番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)是一种世界范围分布危害的植物病毒,分类上属双生病毒科菜豆金色花叶病毒属成员,主要由烟粉虱以循回持久方式传播。该病毒2006年在我国上海出现发生危害报道,之后陆续扩散蔓延至各番茄产区,给当地的番茄等作物生产造成了毁灭性的危害。TYLCV是一个典型的单组分双生病毒,其基因组只有一个单链环状DNA组分(DNA-A),编码6个ORF,其中正义链上编码两个蛋白:V1(CP)和V2,反义链上编码4个蛋白:C1(Rep)、C2(TrAP)、C3(REn)、C4。已有报道显示V1、V2和C4都参与了病毒的运动,其中V1参与病毒在细胞核与细胞质的转运,C4参与了病毒的胞间运动,但V2在运动中的角色一直存在争议,同时V2又是重要的致病因子,其致病机理也不明确,本论文选择V2和C4作为主要研究对象,对其在病毒运动扩散及致病等过程的作用机理展开研究,以期解析V2在致病过程中的作用机理及其与C4蛋白参与病毒运动的作用方式。为了更好的研究TYLCV编码的V2蛋白的运动功能,我们构建了 V2-YFP及YFP-V2融合蛋白表达载体,观察发现V2蛋白主要定位于细胞质和细胞核周边,并且在细胞质中形成多聚的小体,类似的聚合小体在TYLCV侵染时也有报道,推测V2蛋白可能以不同的聚合形式行使不同的功能。将V2蛋白与不同的marker共定位,发现V2与ER、actin、微管都存在共定位现象,ER、actin、微管都与蛋白的转运有关,表明V2蛋白可能在病毒与寄主互作时参与了相关蛋白的运输过程。针对V2在细胞核及核周定位进行观察时发现V2蛋白在细胞核周有较强的荧光信号,V2序列分析发现V2蛋白的N端有一个核输出信号,研究发现NES信号对V2的核周定位有重要的作用,暗示了 V2蛋白可以实现从细胞核到细胞质的核输出功能。已有研究表明V1蛋白能结合病毒基因组DNA,帮助病毒DNA进入寄主植物细胞核(复制),再由细胞核输出到细胞质(转录)。本研究经Co-IP实验发现V2与V1蛋白存在互作,二者共表达时V2蛋白不仅能促进V1蛋白在细胞中的表达,还能改变V1蛋白的核定位,使其只定位于细胞质和细胞核周(V1蛋白在细胞质及核内均有分布),说明V2蛋白增强了 V1蛋白的核输出,结合V2 NES信号的作用,表明V2蛋白很可能参与了 V1-DNA复合体由细胞核到细胞质转运。在研究TYLCV编码蛋白协同作用时,我们发现V2蛋白自身也存在互作,并利用Y2H、BiFC、Co-IP方法进行了验证,进一步实验发现S71A突变体丧失了与V2互作的特征,说明71位Ser对于V2的自身互作是至关重要的。研究S71A突变体对V2蛋白定位的影响时发现V2S71A并不改变V2在本氏烟细胞中的定位,但会导致聚合小体数量减少。为了研究V2S71A形成聚合小体数量减少的原因,我们使用抑制剂分别对actin、微管及26S蛋白酶体进行处理,结果显示26S蛋白酶体受抑制后V2S71A形成的多聚小体数量增幅较大,后期二者形成的多聚小体数量相当,说明26S蛋白酶体对互作缺陷型突变体S71A的降解效率更高,进而影响多聚小体的数量,暗示了 V2蛋白自身互作可能涉及病毒编码蛋白应对寄主26S蛋白酶体降解的一种自我保护机制。同时实验发现S71A也会影响V2的致病性,利用PVX异源表达系统研究V2蛋白的致病特征发现V2蛋白能增加PVX积累量来加重PVX的症状,而V2S71A引起的症状与单独接种PVX相近;对野生型TYLCV及V2突变型(S71A)TYLCV的侵染性进行了测定,结果发现S71A突变后会减弱TYLCV侵染的症状,同时导致病毒DNA积累量减少。这些结果说明71位点的Ser对于V2的致病性有重要作用,而S71A又是V2自身互作的关键位点,表明V2自身互作参与了 V2的致病。除TYLCV自身编码的蛋白外,V2也有报道显示与寄主因子(SGS3,CYP1等)存在互作。在利用酵母双杂交系统筛选V2互作候选因子时,我们发现了一个番茄谷氧还蛋白(s1GRXC6)与V2互作,进而克隆了 slGRXC6基因全长,序列分析结果显示它属于CC类谷氧还蛋白,含有保守的谷氧还蛋白功能域和一个CCMC基序。为明确其与V2蛋白的互作机制,我们利用Y2H、BiFC、Co-IP等方法验证了 V2与slGRXC6在体外和体内条件下均能发生互作。根据V2蛋白功能域分析,我们构建了不同的突变体,研究发现85位Cys是V2与s1GRXC6互作的关键位点。亚细胞定位观察结果显示C85A突变破坏了 V2蛋白的细胞核周定位,同时多聚小体的数量也锐减,致病性测定结果显示C85A突变减弱了 V2蛋白的致病性,表明V2与slGRXC6的互作可能参与了 V2的致病。为更进一步的了解V2蛋白与slGRXC6的作用机理,我们对二者的亚细胞共定位进行了观察,结果显示单独浸润时slGRXC6主要定位于细胞质和细胞核,而V2和slGRXC6共浸润时slGRXC6改变了 V2的定位,在细胞核内也发现有V2表达,说明V2和slGRXC6的互作发生在细胞质和细胞核内,二者BiFC的实验中也有类似的结果。为了解V2和slGRXC6互作的生物学意义,我们检测了 TYLCV侵染时番茄体内s1GRXC6基因的表达量,结果显示病毒侵染会诱导slGRXC6的表达上调,分别利用PVX异源表达系统及转基因技术在寄主体内过量表达V2,结果发现V2过量表达会诱导寄主出现植株矮化、叶缘黄化等症状,同时也会诱导slGRXC6表达上调。而在植物体内过量表达slGRXC6会诱导寄主植株增高,在接种TYLCV时过量表达株会表现发病迟、病毒积累量低等特征;slGRXC6基因沉默株会表现矮缩症状,接种TYLCV植株发病早,病毒积累量高。这些结果似乎说明V2表达会诱导番茄体内slGRXC6基因的表达,激活slGRXC6诱导的寄主防卫反应。推测TYLCV侵染时存在大量的V2,其与slGRXC6结合形成slGRXC6-V2复合体,致使大量的s1GRXC6以这种复合体形式存在,而未结合V2的slGRXC6蛋白积累量降低,从而表现矮缩等症状。为进一步解析s1GRXC6-V2复合体及常态slGRXC6的功能,我们对slGRXC6调控基因进行了分析预测,并通过酵母双杂交实验进行了筛选,结果发现slGRXC6与NTRC80之间存在明显的互作关系。为明确V2与slGRXC6的互作对slGRXC6与NTRC80互作之间的关系,我们将V2、s1GRXC6和NTRC80蛋白分别进行体外融合表达和纯化,利用竞争性GST pull down实验进行研究,结果发现随着V2蛋白加入量的递增,被GST-slGRXC6拉下来的NTRC80蛋白量随之减少,表明V2蛋白与番茄体内NTRC80蛋白竞争性结合slGRXC6。推测在TYLCV侵染时,V2与NTRC80竞争性结合slGRXC6形成s1GRXC6-V2复合体,致使常态slGRXC6积累量下降,slGRXC6与NTRC80的结合几率降低,寄主植物生长发育受影响,出现矮缩等症状。在菜豆金色花叶病毒属成员中,很多研究结果显示C4是一个重要的运动蛋白,参与病毒的胞间运动,本研究利用激光共聚焦显微镜对TYLCV C4蛋白的亚细胞定位进行了观察,结果发现C4主要定位在细胞质及细胞膜上,与胞间连丝存在共定位,为研究其在病毒运动中的作用方式,本研究基于前期获得的番茄体内C4蛋白候选互作因子筛选结果,对候选到的互作因子进行全长基因克隆,酵母双杂交和BiFC实验结果显示一个番茄外被蛋白(slCOP)与C4在体内和体外都存在明显的互作关系。外被蛋白是一种膜质相关复合体,可结合运输蛋白分子,自我组装后形成多聚的复合物,在蛋白质转运过程中发挥重要作用。亚细胞定位结果显示slCOP主要定位于本氏烟细胞的细胞质和核膜上,在TYLCV侵染及单独表达C4时,slCOP的表达上调;而利用slCOP过量表达载体获得slCOP过量表达植株在接种TYLCV时C4蛋白的表达会上调,同时病害的显症时间早,病毒积累量高,说明C4与slCOP的互作可能参与了病毒的运动,推测C4通过与slCOP的互作,利用寄主植物的COP转运系统,帮助病毒完成寄主植物体内的运动扩散。