【摘 要】
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CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因功能分析和作物育种材料的创制中具有重要的应用价值。本研究小组在前期开展了玉米百粒重主效QTL的定位,并鉴定了三个调控玉米百粒重的关键候选基因Zm079、Zm080、Zm081。本研究在此基础上,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统在B104背景下分别敲除上述三个候选基因,在T1和T2代不同编辑类型的材料开展了编辑位点检测、基因型鉴定和表型农艺性状鉴定,创制
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CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因功能分析和作物育种材料的创制中具有重要的应用价值。本研究小组在前期开展了玉米百粒重主效QTL的定位,并鉴定了三个调控玉米百粒重的关键候选基因Zm079、Zm080、Zm081。本研究在此基础上,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统在B104背景下分别敲除上述三个候选基因,在T1和T2代不同编辑类型的材料开展了编辑位点检测、基因型鉴定和表型农艺性状鉴定,创制了每个候选基因遗传稳定的编辑材料。获得的主要结果如下:1.各敲除载体编辑效率检测及编辑情况鉴定。基于DNA水平检测4个敲除载体的编辑效率,分别为14.8%,62.5%,41.7%,16.9%。Zm079基因序列CDS区设计的2个靶标处共鉴定到4种编辑类型,分别为1 bp插入和4 bp替换、24 bp替换、2 bp缺失、2 bp插入和14 bp替换;Zm080基因序列CDS区设计的靶标处共鉴定到5种编辑类型,分别为1 bp插入、7 bp缺失、2 bp缺失、11 bp缺失和1 bp缺失;在Zm081基因序列启动子区设计2个相近靶标处共鉴定到4种编辑类型,包括50 bp缺失,4 bp缺失,27 bp替换和1 bp缺失;在Zm081 CDS区设计的靶标1处共鉴定到7种编辑类型,分别包含5种纯合编辑、2种杂合编辑;在靶标2处共鉴定到4种编辑类型。2.T1代各敲除系的表型鉴定。Zm079基因的2个纯合敲除系（Zm079-9、Zm079-32）在穗重、穗长、穗粗、行粒数、穗行数、百粒重6个性状中与对照系NT相比均无显著差异（P＞0.05）,表明Zm079基因未在穗部和籽粒性状发挥作用。Zm080-2、Zm080-9敲除系在百粒重性状中显著降低,Zm080-28在穗重、穗长、穗粗等性状中均显著增加（P＜0.01）,以上3个敲除系的行粒数与对照系NT相比均极显著增加（P＜0.01）。Zm081pro-32、Zm081pro-37在穗重、穗长性状中显著降低（P＜0.01）,而Zm081pro-61敲除系的百粒重性状显著降低;Zm081cds-3敲除系在穗长、百粒重性状中呈显著降低趋势（P＜0.01）,Zm081cds-16敲除系只在穗粗中显著降低,Zm081cds-23与NT相比穗重、穗粗均显著降低（P＜0.01）。说明该基因调控区的功能位点可能对百粒重、穗长、穗重等表型的影响至关重要,可能是通过对Zm081基因表达水平的影响进而调控表型变异,启动子区存在大片段缺失的编辑材料是获得功能突变体的关键。3.T2代各纯合敲除系田间农艺性状考察。Zm079-9纯合敲除系在株高、穗位高、雄穗分枝数性状中呈显著增加趋势（P＜0.01）,表明该基因可能在营养生长早期受到结节结构的生长发育相关蛋白的作用。Zm080-9敲除系中雄穗主轴长与对照系NT相比显著增长（P＜0.01）,表明该基因可能调控早期玉米植株的发育以及茎组织上包皮的形成有关。Zm081pro-36敲除系穗位高显著增加,而Zm081pro-37敲除系穗位高显著降低（P＜0.01）;Zm081cds-16敲除系的株高、穗位高均显著降低,此外,Zm081基因4个敲除系的雄穗分枝数均显著增加,表明关键调控元件的缺失使得玉米植株营养生长过程中的该基因在茎尖分生组织、未成熟的雄穗（SAM、Tassel）组织中表达量发生变化,最终导致了各突变体株系株型性状的变异。通过对利用CRISPR/Cas9编辑系统获得3个基因的编辑后代进行基因型和表型鉴定,验证产量相关性状的功能,得到Zm080-2、Zm080-9、Zm081pro-61、Zm081cds-3显著降低粒重,Zm080-28、Zm081pro-32、Zm081pro-37显著影响穗长,Zm079-9、Zm080-9、Zm081pro-36、Zm081pro-37、Zm081cds-16显著影响株型的一系列可稳定遗传的有效编辑材料,为玉米产量相关基因的功能解析和机制探究奠定基础。
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