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采集麻鸭、鹅、斑头雁和鸬鹚等水禽血清,以辛酸-硫酸铵法提取水禽IgY,利用Hiload16/60 superdex200 prep pg凝胶柱,以500μL上样量、0.3mL/min流速对粗提水禽IgY进行纯化,收集不同洗脱峰进行SDS-PAGE电泳分析,对其重链进行质谱鉴定,经MALDI-TOF/TOF‘图谱分析,并进行蛋白质数据库检索。结果显示,水禽血清的辛酸-硫酸铵提取物主要含3种不同蛋白组分,鸭血清辛酸-硫酸铵提取物主要由IgM、完整型IgY和缺失型IgY(△Fc)组成。
用纯化的麻鸭、鹅、斑头雁和鸬鹚等水禽血清IgY抗原按不同免疫方式组合免疫6-8周龄BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0在聚乙二醇作用下进行细胞融合,以HAT培养基选择性培养后,经间接ELISA筛选和有限稀释法克隆化,获得14株稳定分泌抗鸭IgY单克隆抗体的细胞株,分别命名为:1B6、2C3、2A5、2C10、2E12、2G12、3A8、3F4、4G6、4G12、5C4、5F4、5H9、6F5;获得5株稳定分泌抗鹅IgY单克隆抗体的细胞株,分别命名为:2F7、5D8、6A2、6C1、6D11;获得10株稳定分泌抗斑头雁IgY单克隆抗体的细胞株,分别命名为:1H7、1F1、2A12、2D6、3F1、3G1、4B1、4E4、5D4、7D3;获得5株稳定分泌抗鸬鹚IgY单克隆抗体的细胞株,分别命名为:1G2、4C7、5F12、6G12、7E3。将杂交瘤细胞注入经降殖烷致敏的BALB/c小鼠诱生腹水,获得水禽IgY单克隆抗体。
利用间接ELISA和Western-blotting对水禽IgY单克隆抗体的特异性、腹水效价、对不同水禽IgY的交叉反应性等进行鉴定,筛选出7株能识别15种水禽(麻鸭、鹅、鸬鹚、斑头雁、番鸭、夜鹭、白鹭、遗鸥、斑尾塍鹬、中杓鹬、鸿雁、绿翅鸭、花脸鸭、赤颈鸭、斑嘴鸭)IgY的共同抗原表位单克隆抗体:3A8、5F4、5H9、5D4、7D3、6A2和6D11,其中3A8、5F4、5H9、5D4识别IgY轻链,7D3、6A2、6D11识别IgY重链。同时,鉴定了水禽的种特异性单克隆抗体,1B6特异识别番鸭IgY轻链,4G12特异识别麻鸭和斑嘴鸭IgY轻链;3G1和3F1特异识别鹅及雁类IgY,其中3G1识别IgY轻链,3F1识别IgY重链:1G2、4C7和6G12特异识别鸬鹚IgY轻链,5F12和7E3特异识别鸬鹚IgY及白鹭IgY轻链。此外,2A5、2A12、3A8、3F4、481、4E4、5C4、5D4、5F4、5H9、6A2、6C1、6D11、7D3等单克隆抗体可识别鸡IgY,其中3A8、5F4还可识别猪IgG,5D4能识别牛IgG。