目的：　　近年来，胃癌在全球男性人群中的病死率上升至第三位，女性中第五位，在发展中国家，胃癌的病死率接近2/3，中国胃癌的病死率达到42％。20-40％的患者手术后在2年内复发。一旦复发目前无有效的治疗方案，平均中位生存时间只有6个月。即使进行及时、规范的化疗，中位生存时间仍然不足1年。因此，人们将注意力集中在如何将化疗与有效的靶向药物联合。西妥昔单抗(Cetuximab C225)是一种抗表皮生长因子受体(EGFR)单克隆抗体，已经与化疗联合广泛应用于K-ras、BRAF基因野生型转移性结肠癌、头颈部鳞癌及非小细胞肺癌。在胃癌治疗方面，Ⅱ期临床研究证明西妥昔单抗联合多种以5-氟尿嘧啶为基础的化疗方案延长患者疾病进展时间，提高反应率。但是最近一项大型多中心随机Ⅲ期EXPAND临床研究显示:西妥昔单抗联合顺铂和卡培他滨方案并不能明显延长进展期胃癌患者无进展生存时间。因此，胃癌细胞可能对西妥昔单抗存在耐药。　　目前关于西妥昔单抗耐药机制研究较多，其中替代性通路的活化成为研究焦点。胰岛素样表皮生长因子受体-Ⅰ(ⅠGFIR)是一种跨膜的酪氨酸激酶受体，在很多肿瘤特别是在胃癌中均过表达。配体与ⅠGFIR结合后发生自身磷酸化，进而活化多重信号通路，包括:Ras/Raf/MAPK（促丝裂原活化蛋白激酶）通路及PI3K/Akt（磷脂酰肌醇3-激酶）信号通路，这也是EGFR下游信号通路。因为与EGFR共用相同的信号通路，因此ⅠGFIR替代性活化可能引起西妥昔单抗耐药。有研究表明，乳腺癌细胞中ⅠGFIR过表达与曲妥珠单抗耐药有相关性。另有研究发现在对西妥昔单抗耐药的鼻咽癌细胞中存在ⅠGFIR过度活化。Chad等研究发现，将ⅠGFIR抑制剂联合西妥昔单抗作用于皮肤鳞癌细胞，可明显增强西妥昔单抗敏感性。在胃癌细胞中，是否存在ⅠGFIR的活化，ⅠGFIR活化是否与耐药有相关性，目前还未有相关报道。　　本实验以胃癌SGC7901和MGC803细胞为研究对象，明确胃癌细胞对西妥昔单抗敏感性，判断西妥昔单抗耐药是否与ⅠGFIR活化相关。进而探讨ⅠGFIR活化原因，活化后诱导耐药的机制及逆转耐药方法，为临床治疗提供一定的理论依据。　　材料与方法：　　1、采用MTT法测定细胞活力。　　2、采用集落形成实验观察细胞增殖能力。　　3、采用Western blot检测ⅠGFIR，Src，EGFR，Akt，ERK蛋白的表达。　　4、采用Lipofectamine2000试剂进行瞬时转染。　　5、统计学处理:每次实验重复3次，数据以(x)±s表示，两组间差异采用Students t test分析。P＜0.05有统计学意义。　　实验结果：　　1、胃癌细胞对西妥昔单抗耐药　　通过基因检测结果证实:胃癌SGC7901和MGC803细胞K-ras和BRAF基因呈野生型。　　将0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml西妥昔单抗作用于胃癌SGC7901和MGC803细胞24 h、48 h和72 h，测定增殖抑制率。MTT结果表明:西妥昔单抗作用于两种胃癌细胞，增殖抑制率不足10％。将10μg/ml西妥昔单抗作用于胃癌SGC7901和MGC803细胞14天，进行集落形成实验。结果表明西妥昔单抗作用于胃癌细胞后，与对照组相比集落数量及大小无明显变化。　　Western blot结果显示:西妥昔单抗作用于胃癌SGC7901和MGC803细胞24 h、48h及72 h，从24 h开始EGFR磷酸化明显减弱，ERK、Akt活性均有一定程度减弱。该结果证实，西妥昔单抗在一定程度上封闭了EGFR通路。　　2、西妥昔单抗可诱导胃癌细胞ⅠGFIR活化，ⅠGFIR活化参与西妥昔单抗耐药　　将10μg/ml西妥昔单抗作用于胃癌SGC7901和MGC803细胞0.5h、2h、6h、16h及24 h，Western blot结果显示:西妥昔单抗作用于SGC7901细胞0.5h始，p-ⅠGFIR表达上调，6h表达程度最强，16h活化开始下降。MGC803细胞在西妥昔单抗作用2h始出现ⅠGFIR活化增强，6h活化程度最强，16h时恢复至未加药水平。　　将ⅠGFIR抑制剂—OSI-906(10μM)与西妥昔单抗(10μg/ml)联合或单独作用于胃癌SGC7901和MGC803细胞。Western blot结果显示:西妥昔单抗单药作用于两种胃癌细胞后，ⅠGFIR活化明显增强，Akt活化有一定程度减弱，ERK活化明显减弱;单药OSI-906即可抑制Akt活化，对ERK活化程度无影响;西妥昔单抗联合OSI-906后ⅠGFIR活性被抑制，Akt活性被进一步抑制，两药联合后对ERK抑制作用没有进一步增强。本结果证明:应用ⅠGFIR抑制剂，可抑制由西妥昔单抗诱导的ⅠGFIR活化，同时Akt受ⅠGFIR调节影响更大，而ERK基本不受ⅠGFIR调节。MTT实验及集落形成实验证明:OSI-906可以增强胃癌细胞对西妥昔单抗的敏感性。　　利用瞬时转染技术沉默ⅠGFIR后，将西妥昔单抗作用于胃癌细胞，Western blot结果显示:沉默ⅠGFIR后，与对照组相比，西妥昔单抗诱导的ⅠGFIR活化明显降低，p-Akt表达下调。西妥昔单抗可很好的封闭ERK，沉默ⅠGFIR后对ERK活性影响不大。同时MTT结果证实:沉默ⅠGFIR后，胃癌细胞对西妥昔单抗敏感性增强。　　3、Src参与西妥昔单抗诱导的ⅠGFIR活化并与胃癌细胞西妥昔单抗耐药相关　　10μg/ml西妥昔单抗作用于胃癌SGC7901及MGC803细胞，Western blot结果显示:在SGC7901细胞中，0.5 h始Src出现活化，随时间延长活化程度增加，至16h达到顶点，后逐渐下降。在MGC803细胞中，0.5 h始Src出现活化，6h时达到最高点，随着时间延长活化逐渐减弱。　　将Src抑制剂PP2(10μM)与西妥昔单抗(10μg/ml)联合或单独应用于胃癌细胞后，Western blot结果显示，西妥昔单抗单药诱导两种胃癌细胞在6h出现ⅠGFIR活化，联合应用PP2后，ⅠGFIR活化受到抑制。MTT实验和集落形成实验结果表明:联合应用PP2后，胃癌细胞对西妥昔单抗敏感性增强。　　应用ⅠGFIR抑制剂OSI-906(10μM)或利用瞬时转染技术沉默ⅠGFIR，与西妥昔单抗(10μg/ml)联合或单独作用于胃癌SGC7901及MGC803细胞，Western blot结果显示:西妥昔单抗单药作用2h、6h后可诱导胃癌细胞Src活化，而联合OSI-906或沉默ⅠGFIR后，Src活化被抑制。　　结论：　　1、胃癌SGC7901及MGC803细胞对西妥昔单抗存在耐药。　　2、西妥昔单抗可诱导胃癌细胞中ⅠGFIR活化，导致胃癌细胞西妥昔单抗耐药。　　3、Src介导了西妥昔单抗诱导的ⅠGFIR活化，并最终导致胃癌对西妥昔单抗耐药。