论文部分内容阅读
目的：建立NTCP过表达的HBV感染细胞模型，利用该模型探讨NO供体药物JS-K的抗病毒效应。 方法：⑴牛磺胆酸钠共转运多肽（NTCP)慢病毒载体构建及NTCP-SK-Hep1稳转细胞系的建立：构建NTCP慢病毒重组质粒Gv-NTCP，挑取克隆进行PCR扩增和序列测定；将阳性重组质粒Gv-NTCP与慢病毒辅助质粒共转染人胚肾HEK293T细胞，包装Gv-NTCP慢病毒、测定其滴度；Gv-NTCP慢病毒感染人肝癌细胞株SK-Hep1，嘌呤霉素筛选，通过荧光显微镜，实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法（Western blot）检测NTCP的表达；⑵构建HBV阳性血清感染NTCP-SK-Hep1细胞模型：二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide， DMSO）、地塞米松预处理NTCP-SK-Hep1细胞系2d，HBV阳性血清、4％聚乙二醇8000（PEG）共孵育NTCP-SK-Hep1细胞系16 h，建立HBV感染细胞模型，设NC-SK-Hep1细胞系为对照组进行感染实验，通过酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）及荧光探针定量PCR技术验证细胞模型是否构建成功；⑶JS-K抗HBV的效应初探：不同浓度的JS-K作用于HBV感染细胞模型，设病毒对照组及恩替卡韦（Entecavir，ETV）阳性药物对照组，采用四甲基偶氮唑盐（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl Tetrazolium bromide，MTT）比色法、ELISA、荧光探针定量PCR技术检测JS-K对细胞的增殖抑制作用及对细胞上清中的乙肝病毒表面抗原（Hepatitis B surface Agent，HBsAg）、乙肝病毒e抗原（Hepatitis B e Agent， HBeAg）及HBV DNA含量的影响。 结果：①NTCP慢病毒载体构建及NTCP-SK-Hep1稳转细胞系的建立：测序结果证实Gv-NTCP慢病毒载体构建成功；在HEK293T细胞中包装的Gv-NTCP重组慢病毒滴度为2.0×108 TU/mL；Gv-NTCP重组慢病毒感染SK-Hep1细胞后，在荧光显微镜下可见感染细胞表达绿色荧光，PCR及凝胶结果显示感染组的NTCP表达明显增高（P<0.05），Western blot结果显示感染组的NTCP蛋白表达明显增高（P<0.05），表明NTCP-SK-Hep1细胞构建成功；②HBV阳性血清感染NTCP-SK-Hep1细胞模型的构建：NTCP-SK-Hep1细胞系及NC-SK-Hep1细胞株经过预处理后进行HBV感染，感染后第2天到第6天，细胞能够持续分泌HBsAg及HBeAg，细胞上清中也能够持续检测到HBV DNA，且NTCP-SK-Hep1组的表达水平均明显高于NC-SK-Hep1组（P<0.05），检出时间也长于后者。③JS-K抗HBV的效应初探：MTT结果显示JS-K在小于10μM的浓度范围内对HBV感染的NTCP-SK-Hep1细胞无增殖抑制作用， JS-K的IC50为60.6μM。ELISA结果及PCR结果提示，JS-K作用细胞24 h、48 h均有抗病毒活性，该前体药物在两时间点的作用效果表现为浓度依赖性（P<0.05）。 结论：⑴HBV感染NTCP-SK-Hep1细胞模型是进行体外抗HBV药物筛选的有效工具；⑵NO供体药物JS-K在体外有一定的抗HBV作用。