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研究背景及目的:
心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)多年来一直是人类健康的头号杀手，目前仍然是所有种族和民族群体中发病和死亡的主要原因之一，其病因复杂，发病机制还未完全明确。同型半胱氨酸(Hcy)是一种高反应性的含巯基氨基酸，是蛋氨酸代谢的中间体。遗传异常，营养缺陷，肾脏损伤，年龄，性别以及药物等均可对Hcy代谢发生影响，使hcy水平升高，在健康个体中，血浆Hcy在5到10μmol/L之间，当人体血浆中Hcy水平超过15μmol/L时，称为HHcy。已有多项研究表明高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia，HHcy)与众多心血管病变的发展密切相关，是CVD的风险标志物或独立危险因素，但是HHcy引起血管损伤的具体机制还不十分清楚。内质网(endoplasmic reticulum，ER)的主要作用是进行蛋白质修饰，折叠和钙储存的细胞器。未折叠或者错误折叠蛋白质的累积或Ca2+的不平衡可引起内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)，触发未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)。N-末端位于ER腔中，C-末端位于细胞质中的三种跨膜蛋白包括激活蛋白激酶RNA-依赖的内质网激酶(activated protein kinase RNA-like ER kinase，PERK)，肌醇需要酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)和激活的转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)与葡萄糖调节蛋白78(Glucose regulate protein 78，GRP78)解离，使蛋白的合成减少以及内质网处理未折叠蛋白的能力增加，以保持内质网的稳态，但是当错误和未折叠蛋白聚集过多，超过内质网自身处理能力时，就可导致细胞的功能丧失，诱导细胞的凋亡。已有的研究证实在心力衰竭和缺血性心肌病等中发生了ERS，但是ERS是否参与了HHcy诱导的血管损伤，以及其作用和具体机制还不是十分清楚。本研究通过建立高同型半胱氨酸大鼠和细胞模型，观察内质网应激相关通路分子的表达，以及应用内质网应激抑制剂干预后信号分子的变化，以探讨HHcy致血管重构时是否有内质网应激的参与以及内质网应激参与的具体分子机制。
研究方法:
1．建立HHcy大鼠模型，并用内质网应激抑制剂4-PBA干预，观察血Hcy浓度，血压，血管中膜厚度，检测内质网应激标志蛋白GRP78，GRP94的表达变化及血管平滑肌细胞凋亡比率；
2．培养血管平滑肌细胞，给予高Hcy刺激，并使用PERK抑制剂Salubrinal干预，检测细胞活力，LDH浓度，PERK信号通路相关分子表达变化和细胞凋亡情况；
3．培养巨噬细胞，观察细胞形态，给予高Hcy和/或高胆固醇刺激，观察泡沫细胞形成情况，检测细胞内胆固醇含量，内质网应激标志蛋白GRP78，GRP94的表达变化以及内质网应激抑制剂4-PBA干预后蛋白表达变化，检测M1型巨噬细胞标志物TNFα、IL-6的基因表达，以及M2型巨噬细胞标志物CD163、IL10的基因表达；
研究结果:
1．在蛋氨酸饲料喂养20w后，大鼠血Hcy浓度明显升高，血管中膜增厚，内质网应激标志蛋白GRP78和GRP94表达升高，血管平滑肌细胞凋亡增加，给予4-PBA后GRP78和GRP94表达明显下降，血管平滑肌细胞凋亡减少，部分对抗HHcy引起的血管损害；
2．在5mmol/LHcy刺激下，培养的血管平滑肌细胞活力下降，LDH浓度上升，PERK信号通路被激活，p-PERK凋亡相关蛋白CHOP表达增加，细胞凋亡增加，给予salubrinal干预能够抑制PERK信号通路激活，降低细胞凋亡；
3．加入oxLDL-c后，经Thp-1细胞分化来的部分巨噬细胞吞噬脂肪颗粒转化为泡沫细胞，而同时给予HHcy的大量巨噬细胞吞噬脂肪颗粒转化为泡沫细胞，并且经油红和苏木素染色后可见巨噬细胞内脂质增加明显，经检测证实HHcy干预增加细胞内胆固醇含量，蛋白免疫印迹法显示内质网应激标志蛋白表达水平升高，同时巨噬细胞M2标志物CD163和IL10降低，M1标志物TNFα和IL6升高；给予4-PBA后，观察到泡沫细胞内脂质减少，经检测细胞内胆固醇含量降低，内质网应激标志蛋白表达水平降低，M2标志物CD163和IL10升高，M1标志物TNFα和IL6降低。
研究结论:
1．HHcy能够导致血管损伤，内质网应激参与了这一过程，抑制内质网应激可以减轻血管损伤；
2．HHcy激活内质网应激重要通路PERK信号通路导致凋亡相关分子CHOP表达增加，引起血管平滑肌细胞凋亡，这可能是HHcy致血管损伤的重要机制之一；
3．HHcy可以通过内质网应激途径促进巨噬细胞吞噬脂质颗粒，转化为泡沫细胞，抑制内质网应激可以减弱这一进程；HHcy可以通过内质网应激途径改变巨噬细胞极化由M2转化为M1，这可能是HHcy致动脉粥样硬化的重要机制之一。
心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)多年来一直是人类健康的头号杀手，目前仍然是所有种族和民族群体中发病和死亡的主要原因之一，其病因复杂，发病机制还未完全明确。同型半胱氨酸(Hcy)是一种高反应性的含巯基氨基酸，是蛋氨酸代谢的中间体。遗传异常，营养缺陷，肾脏损伤，年龄，性别以及药物等均可对Hcy代谢发生影响，使hcy水平升高，在健康个体中，血浆Hcy在5到10μmol/L之间，当人体血浆中Hcy水平超过15μmol/L时，称为HHcy。已有多项研究表明高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia，HHcy)与众多心血管病变的发展密切相关，是CVD的风险标志物或独立危险因素，但是HHcy引起血管损伤的具体机制还不十分清楚。内质网(endoplasmic reticulum，ER)的主要作用是进行蛋白质修饰，折叠和钙储存的细胞器。未折叠或者错误折叠蛋白质的累积或Ca2+的不平衡可引起内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)，触发未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)。N-末端位于ER腔中，C-末端位于细胞质中的三种跨膜蛋白包括激活蛋白激酶RNA-依赖的内质网激酶(activated protein kinase RNA-like ER kinase，PERK)，肌醇需要酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)和激活的转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)与葡萄糖调节蛋白78(Glucose regulate protein 78，GRP78)解离，使蛋白的合成减少以及内质网处理未折叠蛋白的能力增加，以保持内质网的稳态，但是当错误和未折叠蛋白聚集过多，超过内质网自身处理能力时，就可导致细胞的功能丧失，诱导细胞的凋亡。已有的研究证实在心力衰竭和缺血性心肌病等中发生了ERS，但是ERS是否参与了HHcy诱导的血管损伤，以及其作用和具体机制还不是十分清楚。本研究通过建立高同型半胱氨酸大鼠和细胞模型，观察内质网应激相关通路分子的表达，以及应用内质网应激抑制剂干预后信号分子的变化，以探讨HHcy致血管重构时是否有内质网应激的参与以及内质网应激参与的具体分子机制。
研究方法:
1．建立HHcy大鼠模型，并用内质网应激抑制剂4-PBA干预，观察血Hcy浓度，血压，血管中膜厚度，检测内质网应激标志蛋白GRP78，GRP94的表达变化及血管平滑肌细胞凋亡比率；
2．培养血管平滑肌细胞，给予高Hcy刺激，并使用PERK抑制剂Salubrinal干预，检测细胞活力，LDH浓度，PERK信号通路相关分子表达变化和细胞凋亡情况；
3．培养巨噬细胞，观察细胞形态，给予高Hcy和/或高胆固醇刺激，观察泡沫细胞形成情况，检测细胞内胆固醇含量，内质网应激标志蛋白GRP78，GRP94的表达变化以及内质网应激抑制剂4-PBA干预后蛋白表达变化，检测M1型巨噬细胞标志物TNFα、IL-6的基因表达，以及M2型巨噬细胞标志物CD163、IL10的基因表达；
研究结果:
1．在蛋氨酸饲料喂养20w后，大鼠血Hcy浓度明显升高，血管中膜增厚，内质网应激标志蛋白GRP78和GRP94表达升高，血管平滑肌细胞凋亡增加，给予4-PBA后GRP78和GRP94表达明显下降，血管平滑肌细胞凋亡减少，部分对抗HHcy引起的血管损害；
2．在5mmol/LHcy刺激下，培养的血管平滑肌细胞活力下降，LDH浓度上升，PERK信号通路被激活，p-PERK凋亡相关蛋白CHOP表达增加，细胞凋亡增加，给予salubrinal干预能够抑制PERK信号通路激活，降低细胞凋亡；
3．加入oxLDL-c后，经Thp-1细胞分化来的部分巨噬细胞吞噬脂肪颗粒转化为泡沫细胞，而同时给予HHcy的大量巨噬细胞吞噬脂肪颗粒转化为泡沫细胞，并且经油红和苏木素染色后可见巨噬细胞内脂质增加明显，经检测证实HHcy干预增加细胞内胆固醇含量，蛋白免疫印迹法显示内质网应激标志蛋白表达水平升高，同时巨噬细胞M2标志物CD163和IL10降低，M1标志物TNFα和IL6升高；给予4-PBA后，观察到泡沫细胞内脂质减少，经检测细胞内胆固醇含量降低，内质网应激标志蛋白表达水平降低，M2标志物CD163和IL10升高，M1标志物TNFα和IL6降低。
研究结论:
1．HHcy能够导致血管损伤，内质网应激参与了这一过程，抑制内质网应激可以减轻血管损伤；
2．HHcy激活内质网应激重要通路PERK信号通路导致凋亡相关分子CHOP表达增加，引起血管平滑肌细胞凋亡，这可能是HHcy致血管损伤的重要机制之一；
3．HHcy可以通过内质网应激途径促进巨噬细胞吞噬脂质颗粒，转化为泡沫细胞，抑制内质网应激可以减弱这一进程；HHcy可以通过内质网应激途径改变巨噬细胞极化由M2转化为M1，这可能是HHcy致动脉粥样硬化的重要机制之一。