心血管疾病是影响人群健康的严重疾病,给患者、家庭及社会带来沉重的经济及精神负担。目前,全世界每年有1700万人死于心血管疾病,其中有一半以上死于心肌梗死。近10年来,我国心肌梗死的发病率持续上升,已接近国际平均水平。2014年,我国成立“心梗救治日”,确定每年11月20日为“中国1120心梗救治日”。心肌梗死是由于冠状动脉痉挛、粥样斑块出血及/或破溃、血栓形成等引起的心肌缺血性疾病。心肌梗死区域血管新生情况是影响心脏功能预后的重要因素。所以如何改善梗死心肌组织血供状况成为心肌梗死的研究热点。目前促进心肌梗死组织再血管化的研究主要集中在干细胞移植和促进血管新生分子两种方式。虽然内皮祖细胞等干细胞可以分化为内皮细胞或旁分泌从而有效地促进心梗区域再血管化进程,但是由于心肌梗死组织免疫炎症性微环境的病理生理学特点,导致较低的干细胞存活率和再血管化的障碍。目前,如何改善心肌梗死组织微环境成为促进内皮祖细胞等干细胞移植的重点。大量的研究揭示VEGF是最著名和最显著的促血管新生的生物分子,VEGF通过与内皮细胞高亲和力受体(酪氨酸激酶受体Flk-1和fms样酪氨酸激酶受体Flt-1)结合促进内皮细胞增殖从而实现血管新生。但是,由于血液中VEGF的半衰期较短(约几分钟),静脉使用VEGF不能有效改善心梗后的心功能和血管新生。当增加静脉使用VEGF剂量,虽然实验动物显示可以轻微改善心功能,可也同时带来了严重的不良反应(肿瘤,糖尿病性视网膜病变,类风湿性关节炎和动脉粥样硬化的风险)。如何实现VEGF心梗区域的靶向递送成为研究梗死心肌再血管化的重要问题,同时也是解决冠状动脉粥样硬化性心脏病药物靶向递送系统的工程难题。药物递送系统开发需要满足以下几个条件:1)较好的生物相容性和安全性;2)临床使用方便易行;3)较高的靶向递送效率;4)较高的载药率;5)良好的药物活性保护。我们从心肌梗死的生理病理学特点出发,筛选体内具有梗死心肌靶向特点的体内固有结构。心肌梗死后最显著的病理生理学特点是缺血性无菌性炎症,炎症细胞渗出和干细胞富集归巢是心肌梗死组织一个明显特点。SDF-1/CXCR4轴在间充质干细胞趋化,归巢到梗死心肌中起着重要作用。SDF-1由缺血心肌内的细胞分泌并控制MSC的募集。MSC通过其表面上的CXCR4与SDF-1结合,沿着SDF-1浓度梯度定向迁移到梗死心肌组织。由于MSC源自骨髓,它们具有良好的生物相容性,所以我们提出基于间充质干细胞归巢特性的VEGF递送系统。如何利用干细胞的归巢特性携带VEGF等生物分子递送梗死心肌成为重要的科学问题。以往的研究主要通过VEGF基因修饰干细胞或者干细胞内携带VEGF纳米粒子的方式,但是这些方式有可能影响干细胞的生物活性、归巢性、生物安全性。我们提出“干细胞表面工程化的方式负载递送VEGF”的方式来规避对干细胞的影响,实现VEGF的靶向递送,促进梗死心肌再血管化进程。干细胞表面工程化是根据间充质干细胞膜表面特点进行表面接枝的工程手段。干细胞细胞膜表面的特点有1)磷脂双分子层所具有的细胞膜表面负电荷层;2)细胞膜磷脂双分子具有的亲脂性特性;3)细胞膜表面具有的生物分子(糖被和蛋白类)。根据干细胞表面特点可以将间充质干细胞表面工程化分为:1)正负电荷聚电解质的层层自组装;2)亲疏水性的自组装方式;3)根据抗原抗体反应的接枝方式;4)根据表面特点进行适配子方式的偶联接枝方式;5)使用化学方式的化学交联接枝方式。第3,4种方式具有免疫原性的问题和第5种方式具有较差的生物相容性问题。为了减少对干细胞的影响和较好的生物相容性,所以采用前两种方式。我们选择使用疏水性接枝和静电相互作用的方式负载VEGF构建细胞膜工程化的心肌梗死药物递送系统。由于心梗组织免疫炎症的不良微环境,导致归巢到心肌梗死区域的表面工程化干细胞被清除和较低存活率,从而影响VEGF在心梗区域的持续释放和再血管化进程。如何改善心肌梗死组织微环境成为促进表面工程化干细胞持续存在、缓释VEGF促进梗死心肌组织再血管化的重要考虑。促进梗死心肌再血管化(内皮祖细胞移植、干细胞表面工程化负载VEGF两种方式)都需要改善梗死心肌组织的免疫炎症微环境,同时改善心梗区域不良微环境也成为心肌梗死治疗的重点和基础。过去十年,许多的研究集中在生物工程、生物材料上,以改善干细胞的生存微环境,最终保护心脏功能。一种可能的策略涉及提供替代的细胞外基质使细胞集中于递送部位的生物材料。脾脏在胚胎时期是重要的造血器官,出生之后是人体最大的免疫器官和大量干细胞寄居器官。大量的实验研究发现,脾脏细胞外基质对于干细胞的存活、旁分泌、分化等多种功能和免疫稳态的调控具有重要的作用。我们提出假设:脾脏细胞外基质可以提高干细胞归巢后的存活,进而实现改善心功能。为此我们制备了温敏性脾脏细胞外基质水凝胶,其温敏性特点(常温下液体,在体内37°C情况下自组装成水胶)是可以用作微创方式递送至心肌,具有较好的临床使用方便性。因此,我们从四个方面深入研究干细胞表面工程化在促进梗死心肌再血管化的作用。一、干细胞自组装在心肌梗死组织再血管化的研究我们开发了一种针对心梗区域的VEGF递送系统,此方法基于层层自组装以后MSC细胞仍然存有归巢特性,从而改善了心梗区域血管生成以及心功能。结果显示,体外实验中层层自组装VEGF包裹的MSC细胞能够持续释放VEGF,并且具有SDF-1趋化性;体内实验证明,负载VEGF层层自组装的MSC能够归巢到心梗区域,促进梗死区域再血管化、改善心功能。这些实验结果揭示:应用层层自组装包裹VEGF到MCS细胞可能有望成为无创治疗心梗的手段。与其他药物递送系统相对比来说,这种负载VEGF层层自组装MSC的药物递送系统有如下优点:1、MSC是体内固有细胞,因其良好的生物相容性,已经被用于细胞治疗以及药物递送;2、药物通过层层自组装被物理包裹在MSC的表面,实验证明能够持续释放药物,并且拥有良好的药物动力学效果;3、通过层层自组装包裹其他药物到MSC表面,可能有望成为治疗其他疾病的有效方法。二、干细胞接枝促进归巢效率、保持VEGF生物活性的研究层层自组装负载VEGF的间充质干细胞由于层状的包裹影响趋化因子与间充质干细胞表面的受体结合,从而减弱了间充质干细胞的归巢能力和药物递送效率。本部分的研究目的是为了改善层层自组装负载VEGF的MSC归巢性,提高VEGF生物活性,我们首次制备了DMPE-PEG-Heparin接枝的MSC。实验结果显示,双亲性的DMPE-PEG-Heparin能通过其亲脂性接枝到间充质干细胞细胞膜的磷脂双分子层上。趋化因子、黏附因子与间充质干细胞表面的受体结合是间充质干细胞的定向归巢的基础。链状接枝方式而非层状的自组装聚电解质层更有助于保持间充质干细胞的归巢性能,层状的自组装聚电解质层可能是通过影响趋化因子与间充质干细胞膜受体的结合进而削弱层层自组装MSC的定向迁移能力。体外实验结果表明肝素/VEGF的方式负载VEGF具有持续性的缓释能力,提高了VEGF在心梗区域的半衰期。这对于心梗修复过程中需要长时间的VEGF作用具有重要意义。三、脾脏细胞外基质水凝胶改善心肌梗死免疫微环境的机制研究目前促进心肌梗死组织再血管化的研究主要集中在干细胞移植和促进血管新生分子两种方式。虽然内皮祖细胞等干细胞可以分化为内皮细胞或旁分泌从而有效地促进心梗区域再血管化进程,但是由于心肌梗死组织免疫炎症性微环境的病理生理学特点,导致较低的干细胞存活率和再血管化的障碍。目前,如何改善心肌梗死组织微环境成为促进内皮祖细胞等干细胞移植的重点。在前两部分的研究中,我们成功构建了具有心梗靶向功能、负载VEGF的层层自组装的间充质干细胞和DMPE-PEG-肝素接枝的间充质干细胞。表面工程化的间充质干细胞具有归巢和递送VEGF至心梗区域参与心梗后修复、改善心肌梗死区域再血管化、提高心梗后心功能的作用。但是当表面工程化的间充质干细胞到达梗死区域后,由于不良的梗死区域微环境将导致归巢的间充质干细胞死亡、被免疫系统清除,从而影响药物递送系统持续地缓释VEGF等药物。如何改善心肌梗死微环境从而避免免疫炎症系统对表面工程化的间充质干细胞的清除成为研究的重要方向。在心肌梗死病理生理过程中,免疫系统起着非常关键的作用。心肌梗死区域免疫微环境的恶化是影响心肌梗死再血管化、心功能恢复的重要障碍,如何改善心肌梗死组织免疫微环境成为重要的靶点和科学问题。过去十年,许多的研究集中在生物工程生物材料上,以改善干细胞的递送和移植微环境,最终改善心功能。常用的策略是利用细胞外基质材料包裹移植,从而改善干细胞移植的微环境。脾脏是人体中最大的免疫器官,并且脾脏组织的细胞外基质在免疫细胞、淋巴生成、免疫平衡等功能过程中起着重要作用。因此,我们提出了一个假设:由脾脏组织的细胞外基质经过脱细胞后制备的凝胶可能会通过优化心肌梗死区域的微环境来增强心脏功能。在这个研究中,我们发明了一种由脾脏组织的细胞外基质经过脱细胞而制成的温敏性水凝胶,当注射到体内时,它可以表现出自组装呈凝胶状的特点。研究结果显示,脾脏水凝胶包含多种结构域和成分,这些结构域和成分可以影响免疫功能,改善心梗组织免疫微环境。在体内,脾脏水凝胶能够促进单核细胞的发育和淋巴管生成,从而加强心肌梗死后的心脏功能,我们的研究结果表明通过免疫生物材料来改善免疫微环境有可能成为用于微创治疗心肌梗死的新技术。四、脾脏细胞外基质水凝胶通过提高干细胞促进梗死心肌再血管化、改善心功能的研究在前两部分的研究中,我们成功构建了具有心梗靶向功能、负载VEGF的层层自组装的间充质干细胞和DMPE-PEG-肝素接枝的间充质干细胞。第三部分成功制备脾脏细胞外基质水凝胶,结果显示脾脏细胞外基质水凝胶具有调控免疫微环境的作用。进一步,我们研究脾脏细胞外基质水凝胶是否可以提高干细胞在心梗区域的存活具有重要的意义,将为未来细胞表面工程化的干细胞和细胞治疗提供新的策略和工具。脾脏在胚胎时期是重要的造血器官,出生之后是成体干细胞的重要寄居器官。大量的研究表明,脾脏细胞外基质对于干细胞的存活、旁分泌、分化等多种功能具有重要的作用。由于EPC的易于分离培养和促进血管新生的特点,是干细胞治疗的重要细胞,我们选择EPC作为研究脾脏细胞外基质水凝胶对干细胞生存研究的模式分子。在研究中,我们将负载EPC的脾脏细胞外基质水凝胶注射到大鼠心梗模型,研究其对EPC的存活和心功能影响。研究结果结果表明,EPC在脾脏细胞外基质水凝胶上具有较低的凋亡率和良好的存活效果。动物实验结果显示,脾脏特异性ECM水凝胶有效改善了EPC的存活并增强了心脏功能。