乳腺癌是危害女性健康常见恶性肿瘤之一。放射治疗是乳腺癌治疗的重要手段之一,然而由于个体或肿瘤细胞对射线的辐射敏感性存在差异,导致放疗疗效的差异。在放疗中,利用各种辅助手段降低肿瘤细胞的辐射抗性,增加其辐射敏感性,是提高肿瘤放疗疗效的重要途径。因此,研究X-射线对乳腺癌细胞生物学特性的影响及相关蛋白的表达变化,对于提高肿瘤细胞的放射敏感性并了解其相关分子调控机制具有重要的理论意义。1.X-射线辐射对乳腺癌细胞MDA-MB-231生物学特性的影响目的:比较不同剂量的X-射线辐射对乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、周期和凋亡的影响,分析其生物学特性与细胞辐射敏感性关系。方法:选择指数生长期的乳腺癌MDA-MB-231细胞,不同剂量(0、1、2、4、8、10 Gy)的X-射线辐射后24 h,48 h和72 h采用MTT法检测MDA-MB-231的增殖能力,比较不同剂量的X-射线辐射对MDA-MB-231细胞的生长抑制作用;辐照后24 h和48 h,采用PI单染法和Annexin V/PI双染法分别检测细胞周期分布与凋亡,通过流式细胞仪计算并分析不同剂量的X-射线辐射对MDA-MB-231细胞周期与凋亡的影响。结果:MTT实验结果显示,X-射线辐射后,在24 h、48 h和72 h时间点上,各剂量点的MDA-MB-231细胞增殖能力减弱,其抑制率随剂量和时间的变化而变化。在48h和72h时间点,细胞的抑制率随剂量的增加而增加;但72 h各剂量点的抑制率显著低于48 h各剂量点的抑制率,24 h时间点上各剂量点和对照组相比均表现出一定的抑制作用;在各剂量点,细胞的抑制率都随着时间的延长呈先上升后下降的趋势。凋亡结果显示,不同剂量的X-射线辐射MDA-MB-231细胞后,在24 h和48 h时间点,细胞总凋亡率随着剂量的升高而增加,且同一剂量点在照射后24 h的总凋亡率大于48 h的总凋亡率。24 h和48 h各剂量点的早期凋亡率无明显差异,24 h不存在剂量依赖性,但48 h存在剂量依赖性,即随剂量的增加细胞凋亡逐渐增多;24 h和48 h各剂量点的晚期凋亡率存在明显差异,24 h和48 h均存在剂量依赖性,且同一剂量24 h的晚期凋亡率高于48 h的晚期凋亡率。细胞周期结果显示,X-射线辐射后24 h和48 h,乳腺癌MDA-MB-231细胞的周期影响主要表现为G2/M期周期阻滞,24h和48h均表现出细胞百分比随剂量的增加呈现递增趋势,低剂量(1,2 Gy)时,G2/M期阻滞没有显著性差异(P>0.05),高剂量(4,8,10 Gy)照射时,G2/M期阻滞存在显著性差异(P<0.05)。结论:X-射线辐射能有效的抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖,使细胞周期阻滞在G2/M期,并诱导细胞凋亡。2.X-射线辐射后乳腺癌细胞MDA-MB-231差异蛋白表达质谱分析目的:分析X-射线辐射对MDA-MB-231细胞蛋白表达谱的影响,通过比较蛋白表达图谱,筛选、鉴定差异表达蛋白质,进而得到X-射线辐射对MDA-MB-231细胞作用的相关的分子标志物,为以后明确肿瘤放射敏感性的相关机制和相应辐射增敏产品的开发提供帮助。方法:选择对数生长期的MDA-MB-231细胞,4 Gy X-射线辐射(实验组)和不经X-射线辐射(对照组)后48h,对实验组和对照组的细胞总蛋白进行双向电泳,2D凝胶通过Versadoc4000 images system捕获图像。分别在凝胶上选取几个差异明显的蛋白点进行挖点、酶解、萃取、上样,随后使用API 4800串联飞行时间质谱仪MALDI-TOF/TOF(Applied Biosystems)进行分析。结果:通过分析比较,本实验一共筛选出32个蛋白差异点。与对照组相比,实验组细胞中共有17个蛋白点表现为上调,15个蛋白点表现为下调。分别在凝胶上选取32个差异明显的蛋白点进行质谱鉴定,蛋白质谱结果显示8个差异蛋白的具体信息,它们分别是:HSC70,GRP78,IMPDH2,EIF4H,GAPDH,VIM和微管相关蛋白(TUBA1B,TUBA8)。其中HSC70,GRP78,IMPDH2蛋白表达上调,EIF4H,GAPDH,VIM和微管相关蛋白(TUBA1B,TUBA8)表达下调。结论:X-射线辐射影响MDA-MB-231细胞蛋白表达谱。差异表达蛋白质谱鉴定结果显示,X-射线辐射诱导MDA-MB-231细胞热休克蛋白70家族成员HSC70,次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH2),葡萄糖调节蛋白78(GRP78),真核翻译起始因子(EIF4H),甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH),波形蛋白(VIM)和微管相关蛋白(TUBA1B,TUBA8)表达变化。说明这些蛋白作为MDA-MB-231细胞对X-射线辐射的效应物,可能参与细胞的辐射敏感性的调节,同时,这些蛋白可能成为乳腺癌临床放射治疗的生物靶点。