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目的Hes1基因在肝干细胞胆向分化中发挥重要作用,但其具体的作用机制尚不清楚。本研究利用Tet-on真核表达系统,构建了连接目的基因Hes1的载体,在肝干细胞系LEPCs(Liver Epithelia Progenitor Cells,也称为肝原始细胞系)中,筛选出可调控性表达Hes1基因的单克隆来源的细胞,通过检测在表达不同水平Hes1基因的LEPCs细胞中特异性肝细胞及胆管上皮细胞的标志性分子,评价Hes1基因在LEPCs分化中的作用。方法通过构建实验组pTRE2hyg-Hesl和对照组pTRE2hyg-EGFP-Hesl两种可调控性载体,结合pTet-on真核表达系统,分别转染LEPCs并筛选得到稳定表达Hes1基因的细胞系,通过加入不同终浓度(0、0.1、1、5、10、50、100、500μg/ml)强力霉素(Doxycycline,DOX)诱导Hes1基因表达。采用PCR、RT-PCR、Real-Time PCR、免疫细胞化学、Western blot等方法检测并验证Hes1基因在LEPCs中表达的可调控性;采用RT-PCR检测当外在调控性Hes1表达增高时LEPCs表达肝细胞(Gss)及胆管细胞(Krt19、Krt7及Foxa1)的标志性分子,探讨Hes1基因在LEPCs胆向分化中的作用。结果成功构建真核表达载体pTRE2hyg-Hesl和pTRE2hyg-EGFP-Hesl;RT-PCR和Real-time PCR检测结果均显示,随着DOX浓度的增加,Hes1在LEPCs细胞中的表达量也逐渐增加,当DOX浓度为10μg/ml时Hes1的表达可达到最高效率,是未加DOX时的11.21倍,第5天Hes1的表达处于高峰,高峰至少持续到第7天;Western blot检测显示HES1蛋白水平的表达也随着DOX浓度的增高而有所增加,比未经处理的LEPCs的HES1表达量高,同样免疫细胞化学染色也显示转染了pTet-on和pTRE2hyg-Hes1的98%以上的细胞呈阳性反应,着色主要见于细胞核和细胞质。当外源性Hes1在LEPCs细胞中表达量上调后,肝细胞的分子标志物Gss有所下降,胆管细胞分子标志物Krt19等表达出现逐渐增加的趋势。结论可调控性表达载体pTRE2hyg-Hesl或pTRE2hyg-EGFP-Hesl与pTet-on共转染入LEPCs并经筛选后的所得的细胞系,通过加入不同浓度的DOX ,可调控性地诱导Hes1基因的表达,并与Hes1基因的表达存在一定的剂量依赖性。本实验表明当Hes1基因表达增高时,将参与调控肝干细胞LEPCs向胆管细胞方向分化;提示Notch信号通路参与调控肝干细胞分化命运的选择,可能与肝干细胞的分化、增殖,以及肝脏或胆管肿瘤的发生发展有一定密切的联系。本课题为进一步研究和了解Hes1基因的在肝干细胞胆向分化的调控机制提供了一定的理论依据。