肺癌是最常见的癌症之一,也是全球癌症死亡较高的主要原因。根据肺癌的病理特征可以将肺癌分为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）和小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）,其中NSCLC约占85%,SCLC约占15%。在我国肺癌的致死率位居癌症死亡率的首位。肺癌的致病因素较为复杂,最主要的因素是长期大量的吸烟,同时还与一些环境因素、遗传因素等存在相关性。80%肺癌患者有症状就诊时已经发展成为中晚期,即使进行治疗,效果也不理想,患者的生存率低且易复发。目前肺癌的发病机制尚不明确,因此深入研究肺癌的发病机制,寻找有效可靠的分子诊断标记物、开发高效的治疗手段和方法就显得尤为重要。LncRNAs是核苷酸序列长度大于200nt的一类非编码RNA。研究表明LncRNAs在许多癌症中异常表达,它通过表观遗传调控、转录和转录后水平调节基因表达,参与肿瘤的发生和发展。Lnc RNA PGM5P4-AS1是最近发现的一种非编码RNA,研究表明它在不同的肿瘤中存在差异表达,可能发挥调控作用。LncRNAs通过竞争性内源RNA（ce RNA）机制来发挥生物学功能,它可以和miRNA进行靶向结合,进而解除miRNA对靶基因的调控。它是介导细胞生物学过程的功能分子,包括细胞的增殖、分化和凋亡等。前期,我们通过生物信息学方法进行分析,发现PGM5P4-AS1在肺腺癌和肺鳞癌中显著下调,因此我们推测PGM5P4-AS1可能在肺癌的生物学功能中发挥重要作用。本研究将重点探讨PGM5P4-AS1在肺癌中的表达情况、PGM5P4-AS1对肺癌细胞系生物学功能的影响、以及在肺癌中发挥生物学功能的作用机制。希望能为肺癌的早期诊断和分子靶向治疗提供新的靶点,为肺癌的后续研究提供理论依据和实验支持。第一部分PGM5P4-AS1在肺癌组织及细胞中的表达水平分析目的:在所有恶性肿瘤中,肺癌的死亡率高、生存率低、预后差且易复发。前期,我们通过生物信息学方法进行分析,发现PGM5P4-AS1在肺癌组织中存在差异表达,可能参与了肿瘤发生的生物学过程。本部分我们将通过在临床上收集肺癌患者的癌组织和癌旁组织,分析PGM5P4-AS1在肺癌患者中的表达情况;并检测不同的肺癌细胞系,观察其在不同肺癌细胞系中的表达水平,为后续实验的开展做准备。方法:1.我们选择TCGA数据库,通过GEPIA网站（http://gepia.cancer-pku.cn/）中的Boxplots分析PGM5P4-AS1在肺腺癌（LUAD）和肺鳞状细胞癌（LUSC）中的表达情况。2.使用实时荧光定量PCR方法检测肺癌癌组织和癌旁组织共60例（男性25例,女性35;腺癌35例,鳞癌25例）中PGM5P4-AS1基因的表达水平。3.使用实时荧光定量PCR方法检测不同肺癌细胞系中PGM5P4-AS1基因的表达水平。4.使用实时荧光定量PCR方法检测PGM5P4-AS1在五株肺癌细胞系SK-MES-1、NCI-H1437、NCI-H1975、NCI-H2170和A549细胞中的相对表达水平。根据结果选择高表达和低表达的两肺癌细胞株进行后续实验。合成三条PGM5P4-AS1的干扰片段siRNA及其NC siRNA,转染PGM5P4-AS1高表达的细胞株,实验分组为Control、NC siRNA、PGM5P4-AS1 siRNA-1、PGM5P4-AS1 siRNA-2和PGM5P4-AS1siRNA-3五组。构建PGM5P4-AS1过表达载体pc DNA3.1,利用质粒提取试剂盒提取目的质粒,使用q RT-PCR方法对PGM5P4-AS1基因进行扩增并纯化,根据酶切位点对质粒和目的基因进行双酶切,酶切片段使用T4 DNA连接酶连接,最后转入到感受态细胞纯化培养并鉴定,获得过表达载体。质粒构建完毕后,将质粒转染到PGM5P4-AS1低表达的细胞株,实验分组为Control、Vector、PGM5P4-AS1-OE三组。转染48 h后q RT-PCR检测PGM5P4-AS1的表达水平,验证转染效果。根据结果选择干扰效果好的两条siRNA进行后续实验。结果:1.生物信息学分析结果显示PGM5P4-AS1在LUAD和肺LUSC中的表达水平显著低于正常组织（P＜0.05）。2.q RT-PCR结果显示与肺癌癌旁组织相比,肺癌组织中PGM5P4-AS1基因的表达水平显著下调（P＜0.05）。3.PGM5P4-AS1基因在A549肺癌细胞中表达水平最高,在SK-MES-1细胞中表达水平最低。干扰和过表达实验结果显示PGM5P4-AS的三条siRNA均能够明显降低A549细胞中PGM5P4-AS1基因的表达水平（P＜0.01）;PGM5P4-AS1-OE的转染显著提高了SK-MES-1细胞中PGM5P4-AS1基因的水平（P＜0.01）。结论:PGM5P4-AS1基因在肺癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织;使用PGM5P4-AS1的干扰片段及过表达质粒去转染肺癌细胞,可以明显调控肺癌细胞中PGM5P4-AS1基因的表达水平。PGM5P4-AS1在肺癌中的差异表达揭示了其有作为分子诊断标记物的潜能。第二部分PGM5P4-AS1对肺癌细胞系生物学功能的影响目的:本部分将重点研究通过调控PGM5P4-AS1基因的表达水平,观察其在体外和体内对于肺癌细胞生物学功能的影响。涉及肺癌细胞系的增殖、迁移和侵袭等。方法:1.A549细胞分为Control组、NCsiRNA组、PGM5P4-AS1 siRNA-1和PGM5P4-AS1 siRNA-2四组;SK-MES-1细胞分为Control组、Vector组和PGM5P4-AS1-OE三组。分别于各组细胞转染后的0 h、24 h、48 h、72 h和96 h,采用MTT方法检测各组细胞增殖情况;转染48 h后,采用流式细胞术检测各组细胞周期变化。2.通过皮下注射方式将SK-MES-1细胞注射到裸鼠右侧腋窝,注射细胞量为2×10~6。待形成肉眼可见的瘤体大小为60-90mm~3后,经尾静脉注射50μg的PGM5P4-AS1-OE质粒载体或对照质粒载体Vector,每周注射三次,在此过程中每三天测量一次肿瘤体积,于第24d左右（具体根据实际情况而定,不要让瘤体超过伦理审查范围）取瘤体称重、测量体积,实验设置分为Vector组和PGM5P4-AS1-OE组。使用实时荧光定量PCR检测两组瘤体组织中PGM5P4-AS1基因的表达水平;免疫组织化学方法检测各组中细胞增殖标记蛋白Ki67的相对表达水平。3.按照方法1中的分组,继续在肺癌中检测PGM5P4-AS1对肺癌细胞迁移和侵袭的影响。分别于转染0 h和24 h后通过划痕实验检测各组细胞的迁移能力;转染48 h后通过Transwell实验检测细胞的侵袭能力。结果:1.MTT实验结果显示从24 h到96 h,通过干扰A549细胞中（敲减）PGM5P4-AS1的表达可明显促进细胞增殖（P＜0.01）;而过表达PGM5P4-AS1能够明显抑制SK-MES-1细胞的增殖（P＜0.05）。2.流式细胞术检测结果显示PGM5P4-AS1基因下调降低了细胞周期中的G1期比例,增加了S期比例（P＜0.01）;而PGM5P4-AS1的过表达增加了G1期比例,降低了S期比例（P＜0.01）。3.裸鼠异种移植瘤实验结果表明PGM5P4-AS1-OE的过表达显著抑制了肿瘤的生长,肿瘤体积和肿瘤重量与Vector组相比明显降低（P＜0.05）。免疫组化结果显示PGM5P4-AS1的过表达能够显著降低细胞增殖标记蛋白Ki67的表达水平（P＜0.05）;q RT-PCR结果显示PGM5P4-AS1的过表达增加了瘤体中PGM5P4-AS1的表达水平（P＜0.01）。4.划痕实验结果显示通过敲减PGM5P4-AS1基因的表达可以明显增强A549细胞的迁移能力（P＜0.05）;而PGM5P4-AS1基因过表达显著抑制了SK-MES-1细胞的迁移能力（P＜0.05）。Transwell实验结果显示PGM5P4-AS1基因的下调明显增加了A549细胞的侵袭个数,增强了肺癌细胞的侵袭活性（P＜0.05）;而PGM5P4-AS1的上调使肺癌细胞的侵袭个数明显减少,降低细胞侵袭活性（P＜0.05）。结论:1.在肺癌细胞中抑制PGM5P4-AS1基因的表达可以明显增加肺癌细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力,同时使更多的细胞周期由G1期进入S期;而过表达PGM5P4-AS1基因则作用相反,能够减弱肺癌细胞的活动。PGM5P4-AS1基因对肺癌细胞的生物学功能有调控作用。2.过表达PGM5P4-AS1基因能够明显抑制肿瘤的生长,瘤体的体积和重量与对照组比明显减小和降低。同时病理实验也证实了过表达PGM5P4-AS1使细胞增殖蛋白Ki67表达量降低,抑制细胞增殖。体内调控PGM5P4-AS1的表达水平可以影响瘤体生长。第三部分PGM5P4-AS1在肺癌中的作用机制研究目的:结合前两部分的实验结果,已经证实了PGM5P4-AS1在肺癌组织中存在差异表达,而且它的表达水平对于肺癌细胞的恶性生物学行为有着重要影响。通过DIANA-Lnc Base V2数据库分析发现PGM5P4-AS1与miR-1275存在靶向结合关系,而miR-1275已被证实在肺癌中发挥致癌作用。因此,我们推断PGM5P4-AS1对于肺癌细胞的影响是有可能是通过调控miR-1275/LZTS3信号轴来完成的。本部分我们将重点探讨PGM5P4-AS1在肺癌中的作用机制。方法:1.实验分组同第二部分细胞实验分组。在各组细胞转染48 h后,使用q RT-PCR检测方法检测各组中miR-1275和LZTS3基因的表达水平。2.转染48 h后,Western blot检测LZTS3及其下游蛋白Cyclin D1、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、Bcl-2和Bcl-xl的相对表达水平。3.使用双荧光素酶实验验证PGM5P4-AS1与miR-1275之间的靶向结合关系。构建含有miR-1275结合位点的野生型PGM5P4-AS1载体（wt-PGM5P4-AS1）以及结合位点突变的PGM5P4-AS1载体（mut-PGM5P4-AS1）,分别与NC mimic或miR-1275 mimic共转染到293T工具细胞中。实验分为四组:wt-PGM5P4-AS1+NC mimic组、mut-PGM5P4-AS1+NC mimic组、wt-PGM5P4-AS1+miR-1275 mimic组、mut-PGM5P4-AS1+miR-1275 mimic组。4.选用SK-MES-1细胞进行挽救实验,验证PGM5P4-AS1是否通过miR-1275/LZTS3信号轴影响肺癌细胞的生物学行为。实验分为两组:PGM5P4-AS1-OE和PGM5P4-AS1-OE+miR-1275 mimic。各组细胞转染48 h后,MTT方法检测细胞增殖情况、Transwell实验检测细胞侵袭情况;转染0 h和24 h后,划痕实验检测细胞迁移情况。结果:1.qRT-PCR的结果显示在A549细胞中下调PGM5P4-AS1的表达可以明显增加miR-1275的表达水平,同时显著降低LZTS3的基因表达水平（P＜0.01）;相反,在SK-MES-1细胞中过表达PGM5P4-AS1基因能够明显降低miR-1257的表达水平,进而增加了LZTS3表达量（P＜0.01）。2.Western blot分析结果表明,LZTS3蛋白的表达水平在各组中的趋势和基因表达趋势一致。另外,PGM5P4-AS1基因的的下调导致Cyclin D1、MMP-2、Bcl-2和Bcl-xl的蛋白水平均显著升高（P＜0.01）;PGM5P4-AS1的过表达显著抑制了肺癌细胞中Cyclin D1、MMP-2、Bcl-2和Bcl-xl蛋白的表达水平,有统计学意义（P＜0.01）。3.双荧光素酶实验分析结果显示wt-PGM5P4-AS1+miR-1275 mimic组的荧光素活性显著低于其它组（P＜0.05）。PGM5P4-AS1和miR-1275之间存在靶向结合关系,通过调控PGM5P4-AS1的表达能够引起miR-1275的变化。4.挽救实验结果显示PGM5P4-AS1过度表达可明显抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;但是miR-1275模拟物能够逆转这种情况,能够促进细胞增殖、增加迁移和侵袭活性（P＜0.05）。PGM5P4-AS1可以通过调节miR-1275/LZTS3信号轴影响肺癌细胞的恶性行为。结论:1.PGM5P4-AS1和miR-1275存在靶向结合位点,PGM5P4-AS1可以抑制miR-1275的表达并促进LZTS3,进而影响LZTS3下游蛋白的表达水平。2.PGM5P4-AS1通过海绵吸附miR-1275进而抑制肺癌细胞的恶性行为。