侵袭(invasiveness)和转移(metastasis)是恶性肿瘤的重要特征，是影响肿瘤治愈率的主要因素。有统计资料表明：80％以上的肿瘤病人死于肿瘤的侵袭和转移。在肿瘤的侵袭和转移过程中，细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)和基底膜(basementmembrane，BM)起着重要的屏障作用，肿瘤细胞必须突破这一屏障，才有可能侵入临近组织或向别处转移。 乙酰肝素酶(heparanase，HPSE)是九十年代末克隆出来的一种内切糖苷酶，可降解ECM和BM中的硫酸乙酰肝素(heparansulfate，HS)，破坏ECM和BM的完整性，直接促进肿瘤细胞的侵袭和转移；同时，HPSE能够通过降解HS，释放并激活储存于ECM中的大量生长因子，促进肿瘤血管的生成(angiogenesis)。而肿瘤微血管的增加不仅为肿瘤提供了充足的血供，加速了肿瘤生长，而且为肿瘤细胞进入血循环创造了极为有利的条件，因此成为促进肿瘤转移的重要因素。迄今为止，HPSE是研究发现的第一个也是唯一一个具有降解HS活性的酶，这使HPSE成为研究抗肿瘤药物极具吸引力的新靶点。 头颈(headandneck)鳞癌(squamouscarcinoma)生长速度快、侵袭力强，是人体常见的恶性肿瘤之一，头颈鳞癌对放化疗敏感度低、抵抗力强，一直是肿瘤治疗的一个难题。目前，国内外关于乙酰肝素酶与头颈鳞癌关系的研究尚未见系统报道，尤其是在低氧状态下，有关乙酰肝素酶与头颈鳞癌的侵袭转移、细胞增殖(proliferation)和凋亡(apoptosis)、化疗抵抗机制以及乙酰肝素酶反义寡核苷酸在头颈鳞癌治疗中的作用机制的研究尚未见系统报道。因此深入探讨低氧状态下乙酰肝素酶在头颈鳞癌发生发展和转移中的作用机制及影响因素，进而探寻以乙酰肝素酶为靶点的有效治疗头颈鳞癌的思路及方法是头颈鳞癌临床治疗的一条新途径。 本研究共分三部分： 第一部分：HPSE在头颈鳞癌组织中的表达及其临床意义 目的 探讨HPSE在人类头颈鳞癌组织中的表达及其与头颈癌侵袭转移和血管生成等临床病理特征的关系。 方法 研究对象：62例术前未经放、化疗的头颈肿瘤手术切除标本，其中50例患者术后证实有颈部淋巴结转移，12例患者术后证实无颈部淋巴结转移；年龄42～73岁；平均年龄61岁。标本均经10％福尔马林固定，常规石蜡包埋。这些病例均有完整的随访资料，随访时间为术后6-49个月。取8例相应的癌旁正常粘膜组织作对照。依据WHO诊断标准3级法进行病理分级，其中Ⅰ级(高分化)12例，Ⅱ级(中分化)40例，Ⅲ级(低分化)10例。按2002年UICCTNM分期标准：Ⅰ-Ⅱ期9例，Ⅲ期24例，Ⅳ期29例。这些标本用于免疫组化检测HPSE、CD44和VEGF的表达情况。 结果 HPSE在正常头颈部粘膜上皮中不表达或很少表达；HPSE在大多数头颈肿瘤组织中呈阳性表达，主要为胞浆表达，少数表现为细胞核或细胞膜表达；在62例肿瘤组织中有43例阳性表达，其中(-)19例，(+)26例，(++)9例，(+++)8例，阳性表达率为69.3％；在50例转移淋巴结中肿瘤细胞有40例阳性表达，阳性率为80％。 HPSE的表达与病人的年龄、肿瘤的病理分级无显著相关性(P＞0.05)，而与头颈部肿瘤有无淋巴结转移以及肿瘤的临床分期显著相关(P＜0.05)；计算机图像分析显示：正常粘膜对照组、不伴淋巴结转移的肿瘤组与有颈淋巴结转移原发肿瘤组细胞的平均光密度值依次升高，三组间比较其平均光密度值有显著性意义(P＜0.01)。 在50例伴有颈淋巴结转移的肿瘤组织中，原发肿瘤HPSE的阳性表达率为76％，其淋巴结转移灶中HPSE的阳性表达率为80％，原发灶与其淋巴结转移灶之间HPSE阳性表达率比较无显著差别(P＞0.05)；HPSE在原发灶及其淋巴结转移灶中的表达之间呈明显正相关(r=0.9162，P=0.001)。 结论 1.HPSE在头颈鳞癌中表达显著增高，胞浆表达为HPSE的主要表现形式，核HPSE的表达可能与细胞的分化状态有关。 2.HPSE的表达与头颈鳞癌有无淋巴结转移、肿瘤的临床分期密切相关，有淋巴结转移组HPSE的表达显著高于无淋巴结转移组，临床分期越高，其表达的显著性越明显；而与年龄、肿瘤的分化程度无关；HPSE的表达在原发灶与淋巴结转移灶之间呈正相关。 3.HPSE、CD44和VEGF在头颈鳞癌中表达增高，其表达同肿瘤的临床分期、有无淋巴结转移密切相关；HPSE的表达与CD44和VEGF分别呈正相关。 第二部分：低氧对人喉癌Hep-2细胞HPSE蛋白的表达及其对化疗药物(顺铂)敏感性的影响 目的 探讨低氧对喉癌Hep-2细胞HPSE蛋白表达的影响；在此基础上进一步探讨低氧条件下喉癌Hep-2细胞对化疗药物(顺铂)敏感性的影响。 方法 1.分别在常氧(37℃，5％CO2，20％O2)，和低氧(37℃，5％CO2，2％O2)条件下体外培养喉癌Hep-2细胞，采用流式细胞分析技术和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测常氧和低氧不同时间段Hep-2细胞HPSE蛋白及其mRNA表达的变化；2.将常氧和低氧培养12小时的Hep-2细胞与浓度为2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml的顺铂作用24h，利用结晶紫、流式细胞分析技术检测不同条件、不同顺铂浓度下Hep-2细胞的增殖、凋亡和HPSE蛋白表达的变化。 结果 1.流式细胞学检测结果显示：常氧及低氧6h，12h，24h，36h状态下Hep2细胞HPSE蛋白的相对表达量依次升高，常氧组与低氧6h组比较HPSE蛋白的相对表达量差异有显著统计学意义(p＜0.05)，常氧组与低氧12h，24h，36h组比较HPSE蛋白的相对表达量差异有极显著统计学意义(p＜0.01)，而低氧6h，12h及24h组间FI比较，HPSE蛋白表达量差异有显著统计学意义(p＜0.05)。 2.半定量RT-PCR扩增产物电泳结果显示：常氧及低氧6h，12h，24h，36h状态下Hep2细胞HPSEmRNA的相对表达量随着低氧时间的延长依次升高，常氧组与低氧6h，12h，24h，36h组比较HPSEmRNA的相对表达量差异有极显著统计学意义(p＜0.01)，而低氧6h，12h及24h组间HPSEmRNA的相对表达量比较差异有显著统计学意义(P＜0.01)。 结论 1.低氧环境下人喉癌Hep-2细胞中HPSE蛋白表达增强，且在一定时间内，随着低氧时间的延长HPSE蛋白的表达增加。 2.顺铂可通过抑制细胞生长、增加细胞凋亡以及降低HPSE蛋白的表达来达到治疗肿瘤的目的，且这种作用随着顺铂剂量的增加而增强；低氧在一定程度上可降低Hep-2细胞对化疗药物顺铂的敏感性，具体表现为在低氧环境对Hep-2细胞增殖的抑制增加、细胞凋亡降低以及肿瘤转移相关基因如HPSE蛋白表达的增加。 第三部分：低氧对人喉癌Hep-2细胞侵袭力的影响及HPSE反义寡核苷酸对Hep-2细胞侵袭力抑制的研究 目的 探讨低氧对人喉癌Hep-2细胞侵袭力的影响；同时针对HPSE反义寡核苷酸对Hep-2细胞侵袭力的抑制进行研究 方法 设计合成互补于HPSEmRNA起始密码区的HPSEAS-ODN，以阳离子脂质体Lipofectin包埋后转染人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞，进行常氧(37℃，5％CO2，20％O2)，和低氧(37℃，5％CO2，2％O2)12h培养，采用流式细胞分析技术和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测Hep-2细胞HPSE蛋白及其mRNA表达的变化；在此基础上以Matrigel细胞侵袭试验分别对低氧条件下Hep-2细胞侵袭力的变化及HPSE反义寡核苷酸对Hep-2细胞侵袭力的抑制进行检测。 结果 1.随着反义寡核苷酸浓度的增加hep-2细胞形态有不同程度的改变，表现为细胞体积变小，形态不规则，细胞皱缩，核固缩，胞浆粗糙和分裂相少见等。而正常对照组hep-2细胞形态完整，贴壁生长良好。 2.Matrigel侵袭实验结果显示： (1)常氧组侵袭细胞数与低氧12h组比较有显著差异p＜0.05，常氧组侵袭细胞数与低氧24h，36h组比较有极显著差异p＜0.01，而且随着低氧时间延长，侵袭细胞数逐渐增多，在低氧6-36h期间，低氧引起的细胞侵袭力的提高呈时间依赖性，在低氧条件下，随着时间的延长(0～36h)Hep-2细胞HPSE蛋白的表达与其细胞侵袭力的变化之间呈正相关。 结论 1.低氧条件下人喉癌Hep-2细胞的侵袭力明显增强，Hep-2细胞HPSE蛋白的表达与其细胞侵袭力的变化之间呈正相关，表明低氧条件下Hep-2细胞的侵袭力的增加与HPSE蛋白表达水平增高有密切关系。 2.HPSEAS-ODN可有效的抑制和阻断人喉癌Hep-2细胞HPSE蛋白和HPSEmRNA的表达，其效应呈剂量依赖性；HPSEAS-ODN可显著抑制人喉癌Hep-2细胞的侵袭力，其效应具有剂量依赖性。