机体内的氧化还原反应是推动生命活动的正常有序进行的重要反应之一。当氧化还原反应的平衡被打破,体内的氧化反应远远多于还原反应时,机体就会发生氧化应激。高产奶牛与正常泌乳奶牛相比泌乳量和乳腺代谢率明显增加,高代谢率导致乳腺细胞有氧呼吸大大增强,故极易产生过多的自由基使乳腺处于氧化应激状态。氧化应激不仅会严重损伤奶牛的乳腺,造成血乳屏障破坏,导致细菌入侵乳腺,而且还会损害奶牛的泌乳寿命,甚至导致其他泌乳期疾病如乳腺炎等的发生,给奶牛场造成巨大的经济损失。因此,有效控制高产奶牛乳腺氧化应激具有重要意义。丁酸是一种短链脂肪酸,已有研究表明其具有抗氧化功能,但是机制尚不明确,而且其在奶牛乳腺中的抗氧化作用也未见报道。另外,有研究表明丁酸通过其受体GPR109A起到抗炎、修复肠屏障等多种作用。所以,我们推测丁酸可能通过GPR109A激活抗氧化通路,从而缓解高产奶牛乳腺氧化应激。因此,本实验以高产奶牛及奶牛乳腺上皮细胞为研究对象,系统的研究了丁酸对高产奶牛氧化应激的缓解作用及其机制。首先,为了分析GPR109A和高产奶牛氧化应激的相关性,本实验在奶牛场筛选出高产奶牛(n=10、45±5kg/d)和正常产奶量奶牛(n=10、25±5kg/d),收集血清和乳腺组织,对血清中氧化指标及乳腺组织中GPR109A表达情况进行检测。结果发现与正常产奶量奶牛相比,高产奶牛组血清中丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)和过氧化氢酶(CAT)显著升高,总抗氧化能力(FRAP)显著降低,而谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)没有显著变化;高产奶牛乳腺组织中GPR109A的基因和蛋白水平都显著增加。这些结果表明高产奶牛处于高氧化应激状态,而GPR109A的显著上调可能提示其在氧化应激反应中发挥一定调控功能。其次,为了进一步研究丁酸是否能通过GPR109A缓解氧化应激,本研究利用H2O2诱导原代奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)氧化应激反应模型,在此模型中我们深入的研究了丁酸通过GPR109A起到的抗氧化应激作用及机制。结果发现丁酸钠(NaB)能够显著促进FRAP、GSH和SOD的表达,并抑制MDA和ROS的表达,但是添加GPR109A-shRNA、漆树酸(AA)或全反式维甲酸(RA)后这种作用被抑制。进一步结果发现NaB在BMECs中通过GPR109A/AMPK促进Nrf2核积累和H3K9/14乙酰化,Nrf2和H3K9/14乙酰化相互作用促进抗氧化效应分子的生成。氧化应激往往导致细胞凋亡,为了进一步明确丁酸的抗氧化应激效应,本实验检测了丁酸对奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响。结果发现NaB或曲古抑菌素(TSA)单独处理后会显著减少H2O2诱导的细胞凋亡,而GPR109A-shRNA或RA能抑制NaB的这种作用。这些结果表明丁酸在BMECs中通过GPR109A/AMPK促进Nrf2核积累和H3K9/14乙酰化,并促进后两者相互作用,从而促进抗氧化效应分子的合成,进而起到抗氧化作用。然后,本实验通过对BMECs中添加NaB组和无处理组进行了 mRNA的高通量测序。共发现了上调的mRNA有639个,下调的mRNA有91个,其中与Nrf2和氧化应激相关的基因有41个。通过GO和KeGG分析我们发现丁酸所调节的差异基因主要富集在cAMP信号通路,与G蛋白偶联受体密切相关。互作网络分析结果发现这些蛋白都以互作网络的形式来调控BMECs的各种功能,其中也包括抗氧化功能。最后,为了进一步研究丁酸的抗氧化应激作用在奶牛中的应用机制。本实验在第0、7、14和21 d收集两组奶牛(其中一组饲喂三丁酸甘油酯)的血清、乳清和外周淋巴细胞。试剂盒检测结果发现三丁酸甘油酯能够显著提高FRAP、GSH、CAT和SOD的含量,并且抑制H2O2和MDA的含量。Western blot和qRT-PCR则表明实验组淋巴细胞中GCLC、GCLM、NQO1、Nrf2和HO-1的表达显著上调。结果表明三丁酸甘油酯也能够在临床中缓解奶牛的氧化应激。通过上述研究本文首次系统阐明了丁酸抗氧化应激的作用机制,并且通过高通量测序技术初步阐明丁酸在奶牛乳腺上皮细胞中的重要生物学功能。为奶牛抗氧化应激提供了全新的靶点。