研究背景吸烟可以导致肺癌、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)等常见呼吸道疾病。香烟烟雾中包含的多种化学颗粒物质,长期吸入对肺组织有直接致病作用,香烟中的致癌物质可以导致多种基因突变,癌基因活化而增加肿瘤的发生,多种细胞因子在肿瘤的发生发展中发挥关键作用。如β-连环素(β-catenin)是Wnt信号通路关键的信号传递子,其在细胞的异常定位引起下游靶基因的转录是多种实体肿瘤发生的原因之一,在肺癌的转移和预后中是一种重要决定性的蛋白标志。β-catenin表达程度高的非小细胞肺癌患者往往预后不佳,β-catenin已被认为是肺癌的预后预测因子之一。高迁移率族蛋白Bl(high mobility group box1, HMGB1)同样也是一种细胞内的蛋白,在肺癌患者增高,同样也是肺癌患者预后的评价因子之一。研究发现,HMGB1还和COPD有关,临床上更为常见的吸烟导致组织内氧化应激,免疫紊乱而出现异常的炎症反应,产生慢性气道炎症和组织破坏,肺气肿发生,最终演变成为COPD。COPD是一种以不完全可逆气流受限为主要特征的慢性气道炎症性疾病,发病率和死亡率均较高,据世界卫生组织资料显示,其发病率占第六位,预计到2020年其发病率将增加到第3位。研究报道,社会和经济因素在COPD的发病方面有重要作用。我国是发展中国家,COPD的发病率约占8-11%,在广大农村地区,由于生物燃料的使用,以及经济条件的因素的影响,发病率可能更高。目前认为,COPD并不是仅仅局限于肺部的一种慢性疾病,COPD的炎症能“溢出”至全身导致多个系统的损害,严重影响人体的健康。而目前尚缺乏满意的治疗手段,对其发病机制进行深入研究对COPD(?)勺预防和治疗具有十分重要的意义。COPD的发病原因现在尚不完全清楚,一般认为,其与吸烟、生物燃料使用等环境因素有密切关系。香烟烟雾等有害气体或有害颗粒吸入肺内可导致异常炎症反应。如烟草中含有大量细菌内毒素,吸烟烟雾中可以检测到脂多糖。正常人吸入脂多糖后出现胸闷、咳嗽、呼吸困难、多痰及FEV1值明显下降等。支气管肺泡灌洗液(BALF)中中性粒细胞增高和TNF-a、IL-1β、IL-6及IL-8含量增加。大多数COPD患者有长期的吸烟史,但仅仅部分吸烟者发展成为有临床意义的COPD患者,提示吸烟因素等环境因素以及患者本身体质,均与是否发病有关。吸烟导致的慢性炎症,在戒烟后仍能维持相当长的时间,均提示导致吸烟导致COPD的机制本身较为复杂,仍然有待进一步研究。氧化应激是气道炎症的重要发生机制之一。吸烟能导致肺内严重的氧化应激。香烟烟雾中包含有各种颗粒以及自由基,活性化学物。烟草烟雾微粒中包含有4500多种化合物,如一氧化碳、氮氧化物、氨、丙稀醛、苯炳芘、对苯二酚和烟碱等,这些物质能在肺产生沉重的氧化负荷,诱导炎症并直接损害肺组织,产生各种病理变化,包括炎症、肺组织破坏和肺气肿形成、小气道纤维化、粘液高分泌和骨骼肌萎缩等。烟草烟雾中还含有高浓度的活性氧自由基(ROS),吸烟导致的炎症激活的吞噬细胞和中性粒细胞也释放ROS,最终使气道和肺内产生高浓度的ROS,破坏了氧化／抗氧化平衡,导致氧化应激.活性氧能导致炎性反应,气道高反应,诱导凋亡,损害保护抗蛋白酶的功能,降低糖皮质激素治疗COPD(?)勺活性。研究显示,肺气肿的吸烟者与吸同量烟而肺功能正常的人相比,前者肺内有多倍增加的巨噬细胞、T细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞。这表明已有肺气肿的患者具有放大对吸烟的炎症反应。在慢性香烟暴露的鼠模型中,放大的肺内炎症包括吞噬细胞、中性粒细胞、T细胞与肺气肿的发展之间有明确的相关性这些炎症细胞及介质共同参与了COPD的慢性炎症过程。COPD患者肺内各种炎症细胞和炎症因子的异常,以及肺外其它系统器官均受明显影响,提示患者体内存在的免疫紊乱。树突状细胞(dendritic cells, DCs)是目前发现的功能最强的专职性抗原递呈细胞(antigen-presenting cells, APC)在许多炎症发生机制中,DCs承担信号传递放大功能,在接受上游信号激活后,将信息传递给下游效应细胞,最终产生炎症效应。它不仅能促进初始T细胞的增殖分化,而且可以活化CD4±T细胞、CD8±T细胞及细胞毒性T淋巴细胞,在炎症免疫应答中起着关键作用。成熟和未成熟的DCs表型和功能明显不同。正常情况下绝大多数DCs在体内处于非成熟状态,表达低水平的协同刺激分子(CD80、CD86、CD40)和黏附分子。当未成熟DCs在接受外源性抗原、炎性刺激等因素后逐渐成熟,表达高水平MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ类分子、协同刺激分子、黏附分子、整合素等特征性标记(CDla、CD11c、CD83)、热休克蛋白等,并能分泌IL-12、IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等细胞因子。DCs表面还表达某些可特异性结合病原微生物的受体以及免疫球蛋白Fc段受体和免疫球蛋白E分子等,因而能促进细胞介导的免疫应答。目前已知经DC介导的炎症免疫应答有两种模式,分别为病原相关模式分子(Pathogen-associated molecular pattern, PAMP)和损伤相关模式分子Damage associated molecular pattern, DAMP)。PAMP见于各种微生物如细菌病毒的感染,其典型的代表分子为细菌内毒素LPS。DAMP为各种非感染性炎症的主要致病机制分子,其典型代表有高迁移率族蛋白B1(high mobility group box1, HMGB1),尿酸,热休克蛋白等。HMGB1是一种高度保守的非组蛋白染色体结合蛋白,普遍存在于哺乳动物细胞中,正常生理状态下,HMGB1参与基因转录、DNA修复等过程,影响细胞的分化和发育。而HMGB1过表达则有抑制细胞凋亡,诱导细胞分化、细胞迁移、细胞增殖等作用。HMGB1在细胞坏死后凋亡时释放到细胞外。细胞外的HMGB1是种重要的晚期炎症介质和致炎细胞因子,是启动和维持炎症瀑布式反应的关键分子,与多种炎症性疾病的发病机制关系密切。多种细胞主动释放HMGB1,如活化的巨噬细胞／单核细胞。HMGB1作为晚期炎症因子在机体炎症反应中起重要作用,它能诱导细胞分化,产生趋化作用,能够刺激其他炎性因子和趋化因子的释放,如IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、巨噬细胞炎症蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α, MIP-1α)、MIP-1β等。HMGB1还可作用于其他细胞如中性粒细胞,增强炎症细胞因子的表达。HMGB1的主要受体有晚期糖基化终产物受体RAGE和TLRs,两种受体在DCs高表达。HMGB1通过TLR2.TLR4及RAGE等受体发挥作用,一方面促进炎症反应,另一方面促进组织修复,HMGB1在固有免疫及适应性免疫应答中发挥关键作用。HMGB1可经由RAGE活化核因子kappa B(NF-kB)通路,参与氧化应激过程。近年来,已有较多研究开始关注HMGB1/RAGE通路在肺部疾病的作用。已经证实其与机械通气相关性肺损伤、非小细胞肺癌、肺纤维化等疾病密切相关。HMGB1/RAGE在类风湿性关节炎等肺外疾病及机械相关性肺损伤等肺部疾病中起重要作用。有临床研究报道,COPD患者痰液和肺泡灌洗液中HMGB1增高,并与吸烟有关。提示吸烟导致慢性气道炎症的病理机制中,HMGB1可能起重要作用。有研究证明,香烟烟雾对DCs有影响。慢性烟雾吸入小鼠的肺泡灌洗液中DCs数目显著增高,在肺组织中DCs数量也同样增多。吸烟可导致人肺内气道中DCs积聚,BALF中CD40、CD86阳性的DCs增多。吸烟不仅影响DCs的数量,而且对DCs分泌的细胞因子也有显著作用：香烟水溶物可以抑制IL-12而促进IL-10的释放。DCs与已知的慢性气道炎症发病机制中牵涉到的多种炎症因子密切相关,但在炎症发生发展中所起作用尚不明确。综合各种研究文献报道,我们推测COPD的发病机制中可能存在此通路：吸烟导致氧化应激-细胞发生坏死和凋亡-释放出的HMGB1通过活化DCs-刺激T淋巴细胞分化-产生炎症因子-免疫紊乱-进一步导致组织损伤。HMGB-1作为一种重要的晚期炎症介质,在吸烟导致的慢性气道炎症损伤和免疫紊乱、自身免疫中可能起关键作用。氧化应激是该环路中的重要影响因素,抗氧化剂可能阻止该环路而对吸烟导致的肺部慢性炎症有抑制作用。本研究拟采用小鼠吸烟模型实验和小鼠骨髓细胞体外实验,探讨HMGB1作为关键的损伤相关性模式分子,在吸烟导致的慢性气道炎症发生机制中,如何经过DCs途径产生炎症效应；以及抗氧化剂阻止氧化应激后对吸烟导致肺部炎症的干预效果。研究结果将揭示吸烟导致的COPD慢性炎症中异常的免疫机制,以及氧化应激与抗氧化剂的作用,为治疗COPD提供新的思路。鉴于HMGB1是多种炎症发生发展中的重要因子,在肺部损伤、炎症发生过程中起关键作用。与吸烟导致的氧化应激有密切关联。因此,可能在吸烟导致的慢阻肺发病中起重要作用。本研究拟首先确定其HMGB1在吸烟小鼠肺内的变化情况,同时,观察吸烟后肺内DC数量和功能的变化及各种重要炎症因子的变化,以了解HMGB1的变化是否和DC以及炎症因子的变化密切相关；其次,由于氧化应激是吸烟导致肺部炎症的主要发病机制之一,HMGB1(?)(?)作用机制涉及到氧化应激途径,本研究使用抗氧化剂进行干预处理,观察吸烟导致的肺部炎症能否被抗氧化剂所抑制,其抑制作用与HMGB1的作用是否有关。研究分为体外和体内两个部分。第一部分：吸烟小鼠体内HMGB1与树突状细胞的变化及氨溴索的影响第二部分：HMGB1诱导的树突状细胞功能变化及氨溴索的干预影响第一部分：吸烟小鼠HMGB1与树突状细胞的变化及氨溴索的干预作用目的：1.研究HMGB1在吸烟小鼠肺内的表达水平变化2.研究HMGB1在吸烟小鼠肺内的表达及与其它炎症因子的关系；3.研究HMGB1与树突状细胞的关系。4、研究氨溴索对烟熏导致的小鼠肺内炎症有无抑制作用。方法：采用单纯烟熏法制备小鼠气道炎症模型。采用6-8周龄健康Balb/c小鼠,试验过程中小鼠在SPF环境下饲养饲养于符合动物实验要求的省立医院医学研究中心动物实验室。使用自行设计制造,30*40*70cm塑料烟熏箱,上端密闭,下端开口通风。每天将各烟熏及干预组小鼠置于烟熏箱内烟熏30分钟,一天2次,每周连续5天。干预组小鼠在每次烟熏前给予氨澳索0.8mg/g胃管灌入,余同烟熏组烟熏处理。烟熏21周后处死小鼠,留取血液、支气管肺灌洗液和肺组织。进行以下研究：①采用EILSA法检测血液和支气管肺灌洗液中的HMGB1、IL-10和IL-12含量。②留取肺组织标本制成石蜡切片,使用HE染色法病理学检查,观察肺组织小气道和肺泡炎症病理变化,以确定制模是否成功,有无典型的慢性气道炎症和肺气肿病理变化以及氨溴索干预的影响。③采用免疫组织化学方法,检测肺内HMGB1的表达、CDllc、CD83、CD80、CD86(?)勺阳性表达细胞的数量变化。结果：1.烟熏法小鼠气道炎症模型的成功建立与对照组相比,吸烟组和各干预组小鼠肺组织切片在显微镜下可观察到程度不同的炎症性病理变化,小气道腔内分泌物增多,腺体增生,大量炎症细胞浸润,肺泡组织结构破坏,肺气肿形成,符合慢性支气管炎与肺气肿的病理特征。显示本研究采用的烟熏处理方法成功建立了小鼠慢性气道炎症／肺气肿模型。2. HMGB1在烟熏小鼠肺内表达增高烟熏小鼠与对照组相比,肺内HMGB1(?)日性表达强度显著增高,两组间比较其差别有统计学意义(34.71±8.36vs5.57±3.51MOD值,p＜0.01),对照组和烟熏组小鼠血液内HMGBl水平分别是4.0±1.83vs25.75±3.30ng/ml. BALF中HMGB1浓度分别为1.15±0.60vs3.15±0.21ng/ml,烟熏组血和BALF中的HMGB1水平显著增高,与对照组相比其差异有统计学意义.3、HMGB1增高与肺内炎症因子增高呈正相关烟熏后小鼠肺内HMGB1增高的同时,血中IL-12水平也明显增高。烟熏小鼠血中IL-12比对照组显著增高(507.1±149.8vs225.0±17.00pg/ml,p＜0.01),差别有统计学意义。BALF中IL-12的变化和血中的变化相似,吸烟小鼠比对照组小鼠明显增高(131.2±22.57vs86.75±10.41pg/ml,p＜0.05)。各组IL-10的浓度变化不明显,差异无统计学意义。4、烟熏组肺内树突状细胞数量增多,共刺激分子表达增高烟熏小鼠肺组织切片内CD11c阳性的细胞数量较对照组明显增多。共刺激分子CD80、CD86、成熟标志蛋白CD83表达阳性细胞明显增多,部分呈聚集现象。主要集聚在淋巴滤泡。肺组织中树突状细胞总数增多,成熟树突状细胞数量明显增多,并与HMGB的增高呈正相关。5、氨溴索对吸烟导致的细胞因子和DC变化的影响氨溴索干预组小鼠肺内HMGB1表达比吸烟组小鼠有所降低(26.43±3.91vs34.71±8.36,p<0.05),但仍然明显高于对照组(26.43±3.91vs5.57±3.51,p<0.05)。吸烟组和氨溴索干预组小鼠血中HMGB1浓度分别为25.75±3.30vs17.50±2.65ng/ml; BALF中HMGB1浓度为3.15±0.21vs2.37±0.53ng/ml；干预组较烟熏组小鼠增高程度降低,各组之间差异有统计学意义。氨溴索干预组小鼠血中IL-12浓度比吸烟组小鼠降低(238.0±44.49vs507.1±149.8pg/ml,p＜0.01),BALF中IL-12也明显降低(131.2±22.57vs74.31±10.62pg/ml),各组间比较差异均有统计学意义。烟熏导致的HMGB1和IL-12增高均有所下降,同时,树突状细胞数量增多和成熟程度比烟熏组有所降低。结论：1、烟熏可导致小鼠肺内有明显的炎症样病理变化,呈典型的慢性炎症、肺气肿样改变。2、烟熏小鼠肺组织、BAL和血液内HMGB1增高,HMGB1的增高与其它炎症因子的变化有密切关联。IL-12明显增高；肺内树突状细胞数量增多,树突状细胞表面共刺激分子表达增强,肺内树突状细胞数量、细胞成熟度与HMGB1的增高之间存在相关关系。3、氨溴索能抑制烟熏小鼠肺内的炎症变化。其作用可能与HMGB1、DC数量和功能的变化有关。第二部分HMGB诱导的树突状细胞功能变化及氨溴索的干预影响目的：1.探讨HMGB1对树突状细胞的表型和功能影响2.探讨氨溴索对HMGB1(?)寸树突状细胞作用干预影响。方法：1.DC细胞的获取与处理使用细胞裂解法诱导培养树突状细胞。细胞裂解法提取健康雄性6-8周龄Balb/c小鼠骨髓单个核细胞,使用含有浓度20ng/ml的GM-CSF和浓度10μg/ml的IL4的RMPI1640完全培养液培养,隔天半量换液,培养6天后,收集悬浮细胞,检测细胞表面CDllc(?)勺表达,确定为DCso将获得的未成熟DC分为3组,分别为对照组,HMGB1组和HMGB1+氨溴索组。对照组继续使用含20ng/ml的GM-CSF和浓度10ng/ml(?)勺IL4的完全培养液继续培养；HMGB1组细胞在培养液中加入1μg/ml的HMGB1; HMGB1+氨溴索处理组,在加入HMGB1前30分钟,预先加入浓度浓度为100μmol/ml的氨溴索,同上方法继续培养24小时后,分别收集悬浮细胞和培养上清液。进行以下研究：3.表面标志蛋白CDllc、CD83和CD80阳性表达的检测采用流式细胞法检测树突状细胞表面蛋白的变化。首先收集对照组、HMGB1组和氨溴索组DCs约2×105个,PBS洗涤2次后,重悬于PBS中,分别加入PE或FTTC标记的CD80, CD83单克隆抗体,另外收集单独培养的T细胞约2×105个,洗涤2次后重悬,分别加入PE或FTTC标记的单克隆抗体,将上述细胞4℃避光染色30分钟后,洗涤2次,用流式细胞仪分析。4.细胞因子的检测使用ELISA法检测各组上清液中IL10,IL12的含量。流式细胞检测同时,收集培养各组DCs的上清液,分别使用相应的市售ELISA检测盒,按照检测盒说明书推荐的操作步骤,对上清液中的IL-10和IL-12水平进行检测。5.淋巴细胞转化试验脱颈处死Balb/c小鼠,无菌操作下取出脾脏,研磨后过筛网得细胞悬液,用淋巴细胞液分离液分离并过柱得到同种异体小鼠脾脏淋巴细胞,置37℃,5%C02的孵箱中4h,得到的T淋巴细胞用作反应细胞。收集培养第8天的各组树突状细胞,和上述从同种异体小鼠脾脏提取的T细胞混合培养,使用MTT法检测细胞增殖的刺激指数。将上述各组DC细胞设为刺激细胞,T细胞设为反应细胞,将刺激细胞与反应细胞按1：10的比例混合加入96孔板,终体积为200μl/孔。另设空白对照孔,刺激细胞对照孔,反应细胞对照孔,阳性对照孔。放置37℃,5%CO2培养箱中孵育96小时,并于最后4小时时加入MTT,酶标仪570处测OD值,计算刺激指数。结果：1.细胞裂解法诱导培养DC采用细胞裂解法得到的小鼠骨髓单个核样细胞衍生的DC,流式细胞法检测显示其表面CDllc表达达到80%以上,显示诱导培养得到的大多数是DC,得到的DC细胞相对较多,能够满足本研究的需要。2. HMGB1对DCs表面蛋白的影响使用HMGB1刺激后的树突状细胞,其表面的DC成熟标志CD83表达增高(62.54±12.51vs17.94±7.738,p＜0.05)。共刺激分子CD80的表达也明显增强(60.50±18.01vs15.31±8.51；p＜0.05)。各组细胞CD11c的表达无明显差别。3、HMGB1刺激后的DC细胞培养上清液中炎症因子的变化。ELISA法检测结果显示,与对照组相比,HMGB1刺激组细胞培养上清液IL-10和IL-12均有明显增高,对照组和HMGB1组细胞上清液IL-10浓度分别是12.75±4.45；vs47.05±4.25pg/ml,p＜0.01,两组相比其差异有统计学意义,HMGB1组比对照组IL-12增高显著(375.8±36.93vs12.90±1.11pg/ml,p＜0.001)。4、淋巴细胞增殖能力的变化HMGB1刺激成熟的DC,促进淋巴细胞增殖能力明显增强。MTT法检测到的HMGB1刺激成熟的DCs和淋巴细胞混合培养组其刺激指数比对照组显著增高(57.17±6.96vs14.56±3.49,p＜0.001),显示HMGB1能增强DC的促淋巴细胞增殖能力。5、氨溴索对HMGB1刺激DC功能变化的干预作用氨溴索本身对树突状细胞的表面标志CDllc以及共刺激分子CD80、成熟标志CD83表达的影响不明显。单用氨溴索处理细胞时,细胞培养上清液中的IL-10和IL-12均有轻度增高,和对照组相比无统计学意义。氨溴索预处理组细胞培养上清液中的IL-10、IL-12与HMGB1组相比有所降低,其差异有统计学意义(p＜0.05)。氨溴索预处理组与HMGB1组相比,DCs表面分子CDllc无明显变化,CD83、CD80表达均有所下降,两组间差异有统计学意义。淋巴细胞增殖试验中,氨溴索预处理组淋巴细胞刺激指数比HMGB1组明显降低(37.72±3.29vs57.17±6.96,p＜0.05),显示氨溴索能部分降低HMGB1刺激DCs增殖的能力。结论：1. HMGB1能刺激树突状细胞成熟,细胞共刺激作用增强,同时,树突状细胞产生炎症因子IL-12和IL-10显著增多。2.氨溴索能部分抑制HMGB1对DC的刺激成熟作用。