论文部分内容阅读
目的:神经胶质瘤(glioma)是来源于神经上皮的肿瘤,是颅内最常见的肿瘤。国内、外有资料表明,胶质瘤在所有颅内肿瘤中所占的比例约为35.2%~60.9%。肿瘤细胞无限制的增殖是肿瘤的主要特性,肿瘤的恶性程度越高,肿瘤细胞的增殖就越快,DNA复制和细胞分裂的错误就越多,含有损伤的DNA的细胞凋亡也增多。显然,决定肿瘤净增长的是增殖和凋亡这两个因素。p53是重要的抑癌基因之一,p53抑癌基因位于人类17号染色体短臂上,编码一个分子量为53kD的核内磷蛋白。由于其表达及半衰期特性,免疫组化方法通常检测不到野生p53蛋白,而可检测到突变型p53蛋白。p53蛋白阳性表达结果与突变上具有相同含义。新发现的ASPP (Apoptosis stimulating protein of p53 )家族是能特异性地调节p53抑癌功能的蛋白质。ASPP家族的作用主要是通过特异性地影响p53的细胞凋亡功能来实现的。细胞在受到基因损伤的时候,p53基因的表达会大量增加,产生p53蛋白质。p53蛋白能与DNA结合而起着转录调节因子的作用,该蛋白质可以停滞细胞复制来争取修复DNA的时间;或者干脆不修复而直接让损伤细胞死亡,因此可以抑制不正常细胞增生,即可以抑制癌细胞的增生。但p53是通过什么机制,如何来决定细胞是要停止复制或者是进入凋亡程序,这个问题多年来一直是科学家努力想要弄清的问题。ASPP家族的发现则比较圆满的解释了p53是如何决定细胞是要停止复制或者是进入凋亡程序的。在缺乏ASPP时,p53倾向于与停滞基因的启动子结合;而在ASPP存在时,ASPP就会首先与p53结合,引起p53与启动子的亲和性发生改变,这个ASPP-p53复合物倾向于与凋亡基因的启动子结合,从而使基因受损细胞发生程序性死亡。p53凋亡抑制蛋白(inhibitory member of the ASPP family IASPP)可与ASPP1和ASPP2竞争与p53的结合位点,从而影响ASPP与p53的正常结合,起到抑制p53的诱导细胞凋亡能力的作用。本研究采用免疫组化方法检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA),用TUNEL法检测细胞凋亡,探讨二者与肿瘤恶性程度的关系,以及二者之间的关系;通过免疫组化方法检测IASPP、p53在凋亡中的意义,以及二者之间的关系。方法:40例胶质瘤(星形细胞瘤)标本,经10%福尔马林固定,石蜡包埋,连续切片4μm厚。按WHO神经系统肿瘤分类标准(2000年)分为:Ⅰ级7例,Ⅱ级12例,Ⅲ级11例,Ⅳ级10例。一抗:兔抗人IASPP多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司,工作浓度为1:200稀释;兔抗人p53单克隆抗体购自Santa Cruz公司,工作浓度为1:75稀释;鼠抗人PCNA单克隆抗体购自北京中杉金桥有限公司;凋亡试剂盒购自Santa Cruz公司,生物素化山羊抗兔IgG试剂盒及浓缩型二氨基联苯胺(diam inobezidine, DAB)购自武汉博士德公司。免疫组织化学:采用S-P法(Streptavidin-Peroxidase Coiugate Method )采用生物素标记的第二抗体与链霉素抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质色素混合液来测定细胞和组织的抗原,用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)及同等稀释度的正常兔血清替代一抗作空白对照与替代对照。具体步骤如下:①石蜡切片经常规脱蜡至水后,以3%H2O2-甲醇阻断内源性过氧化物酶20min;②经微波修复抗原20min冷却至室温;③正常山羊血清于室温下孵育60min,甩去不洗;④滴加一抗4℃过夜, 37℃孵育30 min;⑤滴加生物素化的羊抗兔IgG37℃孵育60min;⑥滴加三抗37℃孵育50min;除③外每步均以0.01mol/L (pH7.4)PBS振洗3次,每次5min;⑦DAB显色,苏木素衬染,脱水透明,中性树脂封片。PCNA检测:以PCNA为检测指标,常规进行免疫组化染色;以不加PCNA单抗而用缓冲液代替的切片为阴性对照。细胞原位凋亡检测(TUNEL法)检测过程按照实验盒说明书进行,检测时设不加TUNEL反应液的切片,做阴性对照。结果判断标准:凋亡细胞核和PCNA阳性肿瘤细胞核均呈棕黄色。在四百倍显微镜下进行观察,每个标本组织片随机观察六个视野。分别计算每一病例的阳性染色的肿瘤细胞与所测肿瘤细胞的比例,作为凋亡指数(apoptosis index,AI)和增殖指数(proliferative index PI)。p53蛋白主要定位于细胞核,呈棕黄色颗粒状。IASPP蛋白定位于细胞核和细胞质,呈棕黄色颗粒状,表达结果采用半定量法分析。阳性肿瘤细胞的百分比通过400倍高倍镜下至少六个视野确定,并按以下5个范围计分:0分:<1%;1分:1%~25%;2分:25%~50%;3分:50%~75%;4分:>75%。肿瘤细胞免疫染色的强度按如下计分:1分:浅黄色;2分:中等黄色;3分:深黄色。因为肿瘤染色不均一,按主要形式进行评分。阳性肿瘤细胞的百分比和染色强度相乘产生每个病例的加权分数。加权分数=0被定为阴性,其余病例被定为阳性且加权分数<5分为+;>5分为++。统计分析:本文所有数据用SASV8.0软件包完成统计。所有数据用中位数和四分位数间距表示。采用非参数统计的秩和检验,spearman等级相关。结果:①凋亡指数(AI)的测定,胶质瘤中无论分化高低均可见标记的凋亡细胞。40例胶质瘤的凋亡指数范围6.67%~27.40%,中位数和四分位数间距分别为17.07%、7.54%。AI随胶质瘤恶性度增高而升高。②增殖指数(PI)的测定40例胶质瘤的增殖细胞核抗原(PCNA)表达阳性率为100%,增殖指数(PI)范围是(10.22%~50.00%),中位数和四分位数间距分别为27.05%、3.52%。PI随胶质瘤恶性度增高而升高,而AI/PI则随着胶质瘤级别增高而减小,二者呈负相关(rs=-0.36 p<0.05),在所检测的标本中, I、II级病例大多数AI/PI大于0.6;III、IV级病例中AI /PI多在0.6以下。PI和AI之间呈明显正相关(rs =0.90 P<0.05)。③IASPP、p53表达与肿瘤细胞凋亡的相关性:本组40例脑胶质瘤中IASPP表达的总阳性率为75%(30/40)且IASPP随肿瘤级别的增高而升高。p53表达的总阳性率为60%(24/40),P53随肿瘤级别的增高而升高。IASPP阳性组的AI较IASPP阴性组显著降低(P<0.05)。p53阳性组的AI较p53阴性组显著增加(P<0.05), p53表达的加权计分和AI之间呈正相关(rs=0.55,P<0.01),p53蛋白与IASPP蛋白呈正相关关系(rs =0.53 P<0.05)。结论:1、细胞凋亡揭示了肿瘤实际增长和预计增殖之间的差异2、AI/PI可对脑胶质瘤的生物学行为及肿瘤分级有指导意义,AI/PI>0.6恶性度低, AI/PI <0.6恶性度高。3、IASPP随肿瘤级别的增高而升高,IASPP能够和ASPP1或ASPP2竞争性地与p53结合,抑制ASPP1或ASPP2的促进凋亡作用,具有癌基因的功能。4、抑制IASPP的表达有可能促进肿瘤细胞的凋亡,成为肿瘤治疗的新靶点。