论文部分内容阅读
目的：将构建好的肌肉特异性酪氨酸激酶(MuSK)-红色荧光蛋白(mCherry)融合蛋白(MuSK-mCherry)基因,转染在人胚肾HEK293细胞中进行表达,为后续检测重症肌无力患者(MG) MuSK抗体制备抗原。方法：将转化有pMT/BiP/V5-His (MuSK-mCherry)的E coli DH5a扩大培养,提取出质粒,电泳后置于凝胶成像系统中观察其位置确认是否含有pMT/BiP/V5-His (MuSK-mCherry)质粒。分别在放有爬片的6孔细胞培养板和普通6孔细胞培养板中培养人胚肾HEK392细胞,将提取出的质粒转染至人胚肾HEK293细胞中。转染后取放有爬片的6孔细胞培养板第24小时的细胞,通过抗荧光猝灭封片剂封片,凝固后应用共聚焦显微镜在激发波长为587nm、发射波长为610nm处观察荧光图像确认转染表达的情况。在转染后48小时内每6个小时为一时间将转染后的普通6孔细胞培养板中的细胞提取冻存为细胞团。将细胞团统一进行细胞裂解提取出蛋白后,应用免疫印迹检测技术检测表达的融合蛋白,观察条带确认细胞表达情况及转染后每个时间段的表达差异。结果：通过电泳检测于E coli DH5a中提取出的质粒溶液在凝胶成像系统中观察,发现5647bp大小条带,与理论条带位置符合。在HE293细胞中转染后通过免疫荧光图像观察到有红色荧光蛋白,于每6小时的细胞团中提取的蛋白进行免疫印迹试验,可观察到72.4KDa大小条带,与理论条带位置符合,并观察到转染后每个时间段的表达有差异。结论：含有MuSK-mCherry融合蛋白的载体质粒pMT/BiP/V5-His (MuSK-mCherry)可在HEK293细胞中进行表达,获得了MuSK-mCherry融合蛋白。这为后续检查MG患者MuSKAb准备了抗原。