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背景和目的轮状病毒（Rotavirus,RV）是导致5岁以下婴幼儿重症腹泻最常见的病原体,严重威胁着全世界婴幼儿的健康及生命,发展中国家尤为严重。但是目前临床上对于RV感染性腹泻尚无特异的治疗方法。RV感染的症状包括大量腹泻、呕吐以及发热等。目前临床上治疗RV感染性腹泻主要是通过补液来纠正脱水及电解质紊乱,促进小肠对葡萄糖-钠和水的吸收,进而促进肠道功能恢复。2004世界卫生组织（World Health Organization,WHO）和联合国国际儿童紧急救援基金会（United Nations International Children’s Emergency Fund,UNICEF）建议,在RV感染性腹泻病儿童的治疗过程中,应在口服补液盐（Oral rehydration salts,ORS）的同时补充锌剂,6个月以下的婴儿应补充锌剂10 mg/d,6个月～5岁的儿童应补充锌剂20 mg/d,连续10～14 d。长期的临床实践和临床研究证实,补充锌剂能够有效缩短腹泻病程,并预防后续2～3个月腹泻病（迁延性腹泻）的发生。锌是机体诸多代谢过程所必需的微量元素,可作为许多蛋白或酶的辅因子发挥重要调控作用。关于RV感染的研究大多集中于其流行病学研究,但导致感染性腹泻发生的生化及分子机制以及临床补充锌剂有效治疗的理论依据,尤其是锌剂对于肠道一些腹泻发生相关蛋白调控机制方面的作用尚不明晰。基此,深入探索和揭示RV感染性腹泻发生和治疗中的相关机制,寻求RV感染性腹泻干预防治的潜在分子靶点及相应对策,具有重要的理论及实用意义。腹泻的本质在于肠道吸收和分泌的失衡,尤其是水、钠以及葡萄糖等的交换和吸收失衡,其中可能涉及多种腹泻相关蛋白的作用。其中钠-氢交换蛋白3（Na+/H+exchanger 3,NHE3）能够介导肠腔内Na+-H+的交换。而小肠上皮细胞吸收肠腔葡萄糖的途径主要涉及Na+依赖性葡萄糖转运蛋白1（Sodium-dependent glucose transporter 1,SGLT1）和葡萄糖转运蛋白 2（Glucose transporter 2,GLUT2）。在大多数腹泻疾病中,NHE3、SGLT1和GLUT2的表达水平及活性均受到抑制。RV感染亦可能关联细胞内Ca2+和cAMP两种信息分子水平的变化。RV所编码的非结构蛋白4（Non-structural protein,NSP4）可与细胞表面受体结合,并通过磷脂酶C（Phospholipases C,PLC）触发信号级联反应,导致细胞质内Ca2+水平升高,而Ca2+水平的升高会破坏微绒毛细胞骨架。此外,NSP4亦可刺激肠神经系统（Enteric nervous system,ENS）,从而激活Ca2+依赖的Cl-通道,导致Cl-过多的分泌到肠腔,藉此形成渗透梯度,促进水进入肠腔,最终引发分泌性腹泻。同时,刺激ENS后也会激活粘膜下丛神经,进而刺激神经末梢释放血管活性肠肽（Vasoactive intestinal peptide,VIP）后者可增加细胞cAMP水平,最终导致细胞分泌Cl-和水分到肠腔,从而关联腹泻发生。而cAMP可以通过变构激活蛋白激酶A（Proteinkinase A,PKA）,调节细胞内Ca2+信号,即cAMP水平升高可增加胞质Ca2+水平。RV感染性腹泻发生也可能与肠道屏障紧密连接蛋白,NSP4可破坏细胞之间的紧密连接和肠道物理屏障,导致细胞间水和电解质流动,从而可能导致吸收不良引发腹泻。紧密连接结构主要由跨膜蛋白、细胞骨架成分和细胞质斑块组成,其中跨膜蛋白包括闭合蛋白（Claudins）、闭锁蛋白（Occludin）,而细胞质斑块如闭合小环蛋白-1（Zonula Occluden 1,ZO-1）,包含跨膜蛋白的结合域,能够与Claudins和Occludin结合,与紧密连接结构的形成有关,这些都可能与Ca2+水平有密切关联。本研究利用RV感染的极化的Caco2细胞模型和新生鼠离体肠道模型,旨在探讨细胞内Ca2+在RV感染性腹泻中的可能作用及Zn2+的干预效应,以及相关信息分子和腹泻关联蛋白如NHE3、葡萄糖转运蛋白和肠道屏障紧密连接蛋白的表达变化,以期揭示RV感染性腹泻发生及补锌有效干预治疗的可能生化及分子机制,为RV感染性腹泻的综合干预防治提供一定的理论依据。方法1.构建RV感染的离体肠道模型和Caco2细胞模型,探索Zn2+干预效应和适宜的干预剂量。1.1组织包埋和HE染色对不同处理组离体组织进行包埋制备组织切片并进行HE染色,使用光学显微镜观察RV感染及Zn2+干预处理后肠道绒毛的形态学变化。1.2检测NHE3、葡萄糖转运蛋白和紧密连接蛋白表达水平的变化（1）构建RV感染离体肠道模型和Caco2细胞模型,采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测RV感染后NHE3、葡萄糖转运蛋白和紧密连接蛋白的表达改变。（2）利用不同剂量Zn2+对RV感染离体肠道模型组织和Caco2细胞模型进行干预处理,采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测Zn2+干预处理后NHE3、葡萄糖转运蛋白和紧密连接蛋白的表达变化。2.揭示Ca2+在RV感染性腹泻发生中的作用,以及基于cAMP信息分子的Zn2+干预作用的可能分子机制。2.1 RV感染及Zn2+干预处理的Caco2细胞中cAMP和Ca2+水平的变化（1）采用流式细胞法检测各处理组Ca2+水平变化。（2）采用ELISA法检测各处理组cAMP水平变化。2.2 RV感染后添加Zn2+及基于cAMP信息分子干预处理的肠道形态结构的变化对不同处理组离体组织进行包埋制备组织切片并进行HE染色,使用光学显微镜观察RV感染后添加Zn2+及基于cAMP信息分子干预处理后肠道的形态学变化。2.3检测NHE3、葡萄糖转运蛋白和紧密连接蛋白表达水平的变化（1）以RV感染离体肠道为模型,采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测各处理组NHE3、葡萄糖转运蛋白和紧密连接蛋白的表达水平变化。（2）以RV感染Caco2细胞为模型,采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测各处理组NHE3、葡萄糖转运蛋白和紧密连接蛋白的表达变化。结果1.构建RV感染的离体肠道模型和Caco2细胞模型,探索Zn2+干预效应和适宜的干预剂量1.1 HE染色结果与对照组相比,RV感染离体肠道组织经包埋及HE染色后,肠道形态结构均发生明显变化,不同剂量Zn2+干预后,肠道形态结构相对完整。1.2NHE3、葡萄糖转运蛋白和紧密连接蛋白表达水平的变化（1）NHE3表达水平变化:与对照组相比,RV感染离体肠道组织和Caco2细胞模型组中NHE3在mRNA水平和蛋白水平的表达均降低,且差异具有统计学意义（P＜0.05）;使用不同剂量Zn2+干预处理后,NHE3的表达水平上调,尤其是中、高剂量组,且差异具有统计学意义（P＜0.05）。（2）葡萄糖转运蛋白表达水平变化:与对照组相比,RV感染离体肠道组织及细胞模型组,SGLT1和GLUT2在mRNA水平和蛋白水平表达均显著下调差异具有统计学意义（P＜0.05）;使用不同剂量Zn2+干预后,SGLT1和GLUT2的表达水平均上调,其中中、高剂量组显著升高,且差异具有统计学意义（P＜0.05）（3）紧密连接蛋白表达水平变化:与对照组相比,RV感染离体肠道组织及细胞模型组ZO1、Occludin和Claudin1在mRNA水平和蛋白水平表达均显著下降,差异具有统计学意义（P＜0.05）;使用不同剂量Zn2+干预后,ZO1、Occludin和Claudin1的表达水平均上调,尤以中、高剂量组显著,且差异具有统计学意义（P＜0.05）。2.揭示Ca2+在RV感染性腹泻发生中的作用,以及基于cAMP信息分子的Zn2+干预作用的可能分子机制2.1.RV感染和Zn2+及基于cAMP信息分子干预处理RV感染Caco2细胞中Ca2+和cAMP水平的变化（1）Ca2+水平的变化:与对照组相比,经RV干预处理后,细胞内Ca2+水平明显升高,Forskolin处理组Ca2+水平亦显著增加（P＜0.05）;而RV+Zn2+干预处理组,细胞内Ca2+水平则显著性降低,而RV+SQ22536处理组的Ca2+水平亦显著降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。（2）cAMP水平的变化:相比于对照组,RV感染组及Forskolin处理组干预后,细胞内cAMP水平均明显升高（P＜0.05）,而RV+Zn2+处理后,细胞内cAMP水平则显著降低,差异有统计学意义（P＜0.05）,同时RV+SQ22536处理组的cAMP水平亦显著降低（P＜0.05）。2.2 RV感染后添加Zn2+及基于cAMP信息分子干预处理的肠道形态结构的变化RV感染及升高细胞内Ca2+和cAMP水平会破坏肠道完整性,而Zn2+及基于cAMP信息分子干预处理后能够有效保护肠道,维持其完整性。2.3 RV感染和Zn2+及基于cAMP信息分子干预处理后NHE3、葡萄糖转运蛋白和紧密连接蛋白表达水平的变化（1）RV感染离体肠道模型:与对照组相比,Forskolin处理组中NHE3、葡萄糖转运蛋白和紧密连接蛋白在mRNA水平和蛋白水平的表达均降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）,而RV感染后,加入SQ22536进行干预,NHE3、葡萄糖转运蛋白和紧密连接蛋白在mRNA水平和蛋白水平表达均升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。（2）RV感染Caco2细胞模型:与对照组相比,Forskolin组中NHE3、葡萄糖转运蛋白和紧密连接蛋白在mRNA水平和蛋白水平表达均下调,具有显著性差异（P＜0.05）,而RV感染后,加入SQ22536进行干预,NHE3、葡萄糖转运蛋白和紧密连接蛋白在mRNA水平和蛋白水平的表达均显著上调,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论1.RV感染的Caco2细胞中,Ca2+和cAMP水平显著升高。Zn2+干预处理可显著降低Ca2+和cAMP水平。cAMP水平与Ca2+水平升高有密切关联,可能是RV感染性腹泻发生及锌剂有效干预治疗的重要信息分子。2.RV感染的Caco2细胞及RV感染离体肠道模型组织中的腹泻关联蛋白NHE3、葡萄糖转运蛋白和紧密连接蛋白的表达水平显著降低,同时引发肠道黏膜上皮的完整性损伤。Zn2+干预处理能有效改善肠道上皮组织形态结构的变化,且可显著上调NHE3、葡萄糖转运蛋白和紧密连接蛋白的表达水平,可能是RV感染性腹泻发生及锌剂有效干预治疗的重要生化及分子机制之一。