番茄SlPrx应答低氮胁迫的机理分析

来源 :昆明理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:dreamagain1986
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氮(N)是限制植物生长的主要元素之一,氮肥料被广泛用于提高作物产量。减少高氮投入,提高植物的氮肥利用率(NUE)对农业可持续发展至关重要。过氧还蛋白(Peroxiredoxin,Prx)是一类重要的抗氧化酶,具有保护细胞免受过氧化的生理功能,在消除代谢过程中产生的过氧化物方面起着重要作用,是抵御体内过量活性氧(ROS)的第一道防线。本论文主要对番茄过氧还蛋白基因(SlPrx)参与一氧化氮(NO)缓解低氮胁迫的机理及其功能进行研究,取得结果如下:1.研究了外源施加SNP(NO供体)对低氮处理下番茄幼苗的氮代谢系统和SlPrx表达的影响。与对照相比,低氮处理三周后,番茄幼苗植株矮小、根系不发达、生物量下降。0.25 m M低氮胁迫下,番茄根系的ROS和NO含量均显著上升,硝酸盐含量、叶绿素含量、硝酸还原酶(NR)、亚硝酸还原酶(Ni R)和谷氨酰胺合成酶(GS)的酶活性显著下降。与低氮胁迫相比,外源施加100μM SNP,番茄的ROS和NO含量下降,硝酸盐含量,叶绿素含量,NR和GS的酶活性显著上调。与对照相比,低氮胁迫下的番茄SlNRT2.4、SlNR、SlNi R和SlGS2表达量下降。外源施加SNP后,与低氮胁迫相比,SlPrx、SlGrx的表达量显著增加。低氮胁迫后,番茄中S-亚硝基化蛋白增加,S-亚硝基化的SlPrx的蛋白表达量也增加,施加SNP后,S-亚硝基化的SlPrx蛋白表达量进一步增加。以上结果说明低氮胁迫下番茄SlPrx蛋白可能通过发生S-亚硝基化来参与NO缓解低氮胁迫的过程。2.通过原核表达并纯化获得番茄SlPrx蛋白,分析重组蛋白SlPrx在体外清除H2O2以及抗氧化的功能。pET-28a-SlPrx蛋白大小约为29 k D,28℃,0.5 m M IPTG诱导表达8 h为蛋白诱导最佳条件。通过H2O2清除法发现SlPrx重组蛋白具有H2O2清除能力以及过氧还蛋白活性;SlPrx蛋白以剂量依赖性的方式抑制DNA损伤;琼脂扩散法验证了重组SlPrx蛋白在重金属和H2O2胁迫下的抗氧化功能。通过GPS-SNO 1.0预测番茄Prx序列中位于3位和120位的Cystein(Cys)是可能的S-亚硝基化的关键位点,将这两个Cys位点突变为Ser,并进一步获得SlPrx C3S和SlPrx C120S突变体蛋白,发现SlPrx C3S蛋白S-亚硝基化活性降低,表明第3位Cys可能是SlPrx关键的Cys位点。3.通过酵母双杂交(Y2H)、Pull-down实验表明,SlPrx与SlGrx蛋白存在互作。此外,Y2H、Pull-down和免疫共沉淀实验证明SlPrx与硫氧还蛋白(Trxh)存在相互作用。4.构建了植物过表达载体pCAMBIA1301-SlPrx,pCAMBIA1301-SlGrx和基因编辑载体CRISPR-Cas9-p HEE401E-SlPrx、CRISPR-Cas9-p HEE401E-SlGrx,通过农杆菌介导的叶盘法转化番茄,对转基因番茄进行基因组PCR、q RT-PCR、western blot分析,获得了番茄SlPrx的基因编辑番茄植株2棵。SlGrx过表达植株2棵,基因编辑植株2棵。本研究从生理生化和分子水平上,揭示了SlPrx参与番茄应答低氮胁迫的作用机制,有助于丰富我们对蔬菜应答低氮胁迫的机制的认识。
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