碳酸酐酶（CA）广泛存在于动物、植物、微生物及藻类等生命体中,催化CO2和HCO3-之间的转换反应。作为红细胞的主要蛋白质成分之一,动物CA在生物医学方面有大量研究报道。关于植物CA,尤其是βCA,尽管相关研究表明其参与植物体内pH调节、离子交换、生物合成,尤其是光合作用中碳的固定[1-8],但其参与植物生长发育的分子机制的认识还非常有限,尤其是在粮食作物玉米的研究中几乎没有相关报道。此外,现阶段所有关于βCA研究的突变体在正常生长条件下都无明显表型[5-6]。因此,利用模式植物拟南芥为实验材料,获得具有明显生理表型的βCA突变体,发掘βCA在植物中新的功能,为深入研究CA在植物中的作用提供一些理论依据,也为CA在粮食作物玉米中的研究提供一些线索,具有重要的理论和实践意义。主要研究结果如下:第一部分:选取UniProKB数据库中已知定位信息的全序列玉米蛋白质为研究对象,分别用iLoc-Plant,Plant-mPLoc,CELLO,SherLoc2,WoLFPSORT 和 Predotar 亚细胞定位软件对其进行定位预测。对比分析6款预测软件的可靠性,选择预测准确度最高的软件对完整序列的玉米CA进行蛋白质亚细胞定位预测。1.通过筛选,在UniProKB数据库中获得431个具有定位信息的完整序列玉米蛋白质,其中411个定位于一种细胞器（185个定位信息具有实验证据;226个定位信息不具有实验证据）;20个定位于两种或两种以上细胞器,以此为测试集。2.通过比对分析测试集的亚细胞位点与软件预测的结果,发现预测的准确性跟软件、亚细胞位点相关。蛋白质同源性检索方法的软件（iLoc-Plant和Plant-mPLoc）预测准确性要高于蛋白质特征检索方法的软件（CELLO,SherLoc2,WoLF PSORT和Predotar）。iLoc-Plant对具有实验证据的蛋白质定位信息预测的准确度高达84.9%,对所有蛋白质的预测准确度为74.3%;对于定位于不同细胞器的蛋白质,预测准确度最高的为细胞核,其次为细胞质、线粒体、质体、内质网和液泡,准确性较低的为定位于细胞膜以及多细胞器的蛋白质。3.利用预测准确度较高的iLoc-Plant和Plant-mPLoc对17种未知亚细胞定位信息的玉米CA进行亚细胞定位预测,iLoc-Plant预测结果发现有11种定位于叶绿体或质体,5种定位于细胞质,1种定位于细胞膜;Plant-mPLoc预测结果发现17种玉米CA都定位于叶绿体。通过比对蛋白质亚细胞定位软件的准确性,筛选出预测准确性较高的iLoc-Plant和Plant-mPLoc,对新发现或未知定位信息的蛋白质进行亚细胞定位预测,为玉米 CA 的功能分析提供线索。第二部分:通过遗传杂交手段首次获得了在正常生长条件下具有明显生理缺陷的βca1βca2βca4拟南芥三突变体植株,并用遗传互补手段进行了功能互补验证。根据其表型特征对生长和发育的各个阶段进行了生理生化研究,如光合指标的测定;糖、pH以及激素对根生长的影响;碳水化合物的测定;并利用转录组测序技术对其进行了转录组水平分析,探寻了 βCA在植物体内参与的生命过程及其分子功能。1.通过杂交手段获得βca1 βca2 βca3和βca1 ca2 βca4拟南芥三突变体植株,PCR及测序分析鉴定了 T-DNA插入位点,βca1（Salk₁06570C）突变体中T-DNA插入位点在第九内含子,βca2（CS303346）突变体中T-DNA插入位点在第八外显子,βca3（Salk₁44106C）突变体中T-DNA插入位点在第三内含子,βca4（CS859392）突变体中T-DNA插入位点在第四内含子。与野生型相比,βca1 βca2 βca4具有明显生理缺陷,如植株矮小、叶片较厚且绿、育性差、侧枝多以及生长周期长等表型,表明βCAs参与了拟南芥生长和发育中的大多数过程。2.构建了βCA1:βCA2:βCA2.βCA2和βCA4βCA4功能互补转基因载体,对βca1 βca2 βca4三突变体植株进转基因。与野生型相比,功能互补转基因株系生理表型得到恢复,验证了拟南芥植株生理缺陷是由βCA1、βCA2和βCA4共同作用导致的。构建了4x35S-CA1:βCA1过表达载体,对野生型植株进行转基因。与野生型相比,4x 35S-βCA1:βCA1过表达株系具有叶莲座紧凑、较小,叶片圆且较绿,开花时间早、生长周期短等表型,此外,4x35S-βCA1:βCA1过表达株系中有两种不同育性的株系,一种为半不育,另外一种为全不育,不育的植株约占半不育植株的1/3,过表达的研究表明βCA可能参与促进植物的生命进程,或βCA的过量表达导致植物受到胁迫进而加快生命进程。4.对βca1βca2βca4三突变体和4x 35S-βCA1βCA1过表达转基因植株进行了生理指标的测定。βca1 βca2 βca4三突变体纯合子光合效率低于野生型,βca1 βca2 βca4三突变体杂合子光合效率与野生型相似,4x 35S-βC41:βCAi过表达植株光合效率高于野生型;βca1βca2 βca4三突变体气孔指数与野生型相似,但单位面积上的气孔密度大于野生型,表明βCA可能参与植物的光合作用。5.研究了 βCA在拟南芥根生长中的作用。糖对βCA突变体种子萌发初期主根生长影响的研究中,发现在不含糖的培养基上βca1βca2双突变体主根略短于野生型,而βca1 βca2 βca4三突变体种子根几乎不生长,在含1%蔗糖的正常培养基上βca1 βca2 βca4三突变体的主根可以生长,但βca1 βca2和βca1 βca2 βca4主根根长仍短于野生型,随着糖浓度的增加,突变体主根的生长逐渐得到互补。糖对βCA突变体籽苗主根生长影响的研究中,发现βca1 βca2和βca1βca2 βca4三突变体籽苗在不同糖浓度的培养基上其主根根长均短于野生型,无论是在对种子还是籽苗的研究中,βca1βca4均与野生型相似。在对βCA1:βCA1功能互补转基因植株籽苗进行糖处理时,发现其主根根长也短于野生型,而CA2:βCA2功能互补转基因植株则与野生型相同,推测βca2 βca4突变体主根的生长有可能对糖也具有敏感性。研究表明βCA参与植物根的生长。βH对βca1 βca2双突变体根生长的研究中,发现βca1 βca2突变体株系对pH值比野生型略敏感一些;而在激素对βca1βca2双突变体根生长的研究中,βca1βca2突变体植株的根对ABA、IAA和GA3均不敏感。研究表明激素对βca1 βca2突变体植株根的生长不具调控作用,推测βCA与糖、激素共同调节植物跟的生长。6.利用淀粉染色、透射电子显微镜以及淀粉含量测定等研究手段,发现βca βca2 βca4三突变体在黑暗8 h后光照开始时叶片中的淀粉含量高于野生型,而此时淀粉的直接水解产物麦芽糖含量却低于野生型,此外蔗糖、葡萄糖的含量也低于野生型,说明 βCA参与淀粉的降解。光照开始后淀粉的积累速率低于野生型,该结果也表明βca1 βca2 βca4三突变体在光照条件下光合速率低于野生型,与光合指标测定的结果相符。功能互补转基因植株则与野生型相同。7.转录组测序研究发现βca1 βca2 βca4三突变体植株中有986个上调基因,627个下调基因（P-value≤0.05,RDF≤0.05,log2（Fold change）≥1）。选择 value 值大于 5 时的上调基因（608）和下调基因（399）进行GeneOntology聚类分析,发现主要以参与新陈代谢和细胞进程、bingding和酶活性等相关基因为主;Enrichment map分析发现下调基因主要为信号转导、荷尔蒙应答、光合作用、捕光复合物、油菜素内脂应答、胁迫响应、氨基酸代谢、水解酶、转移酶等相关基因,该结果与βca1 βca2 βca4三突变体植株表型以及前期的研究结果相符。本文主要创新点:首次获得在正常生长条件下具有明显生理表型的βca1 βca2 βca4拟南芥三突变体植株,且证明了βCAs参与植物生长发育中大多数生命过程。发现βCA新的功能,如根对糖的敏感性、参与淀粉的降解等。为探寻βCAs在高等植物生长发育中的功能提供理论依据,对发掘βCAs在植物体内的新功能,以及为玉米CA的研究提供线索。