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目的: 白癜风是一种常见并且严重危害患者身心健康的顽固皮肤病,虽易于诊断,但是治疗相对困难,疗程长、收效慢、治愈率低。目前的研究均倾向于白癜风是一种自身免疫性疾病,其中抗原特异性T细胞对白癜风黑素细胞的杀伤是发病的重要因素之一,但其具体机制非常不清楚,是整个白癜风病因学研究的热点和难点。也是本课题研究的重点。既往的研究及我们近期发现CD8+T细胞介导的细胞毒性反应和白癜风黑素细胞内在的破坏性应激反应是白癜风发生发展两个关键因素:(1)抗原特异性CD8+T细胞存在于白癜风皮损周边组织,疾病的严重程度及对黑素细胞的杀伤能力与患者外周血CD8+T细胞的量呈正比。CD8+T细胞导致的黑素细胞杀伤在白癜风的发生发展中是不可或缺的。但CD8+T细胞过度激活的调控机制不清楚。(2)白癜风黑素细胞中存在升高的活性氧簇(ROS),使其处于氧化应激状态。 研究发现,PD-1/PD-L1信号通路在肿瘤免疫抑制中发挥重要作用,该通路的抑制可促进CD8+T细胞的活化。此外,临床研究发现在黑素瘤的治疗中,采用细胞程式死亡配体1(PD-L1)抗体治疗有效的同时,有些患者同时出现白癜风样皮损,这种白癜风样皮损的出现往往预示黑素瘤治疗效果明确,且预后可能较好。这种临床现象进一步推测PD-L1/PD-1信号通路活化T细胞,可能引起黑素细胞的破坏,因此可能在白癜风发病中起重要作用。由此我们推测:ROS负向调节PD-1/PD-L1信号通路,使CD8+T细胞毒性增强,对于白癜风黑素细胞的杀伤作用增强,导致白癜风的发生。 方法: 1.使用流式方法筛选H2O2浓度,体外构建氧化应激模型; 2.通过细胞免疫荧光、免疫组化、RT-PCR、western blot等方法测定并比较白癜风黑素细胞、正常黑素细胞、白癜风角质形成细胞及正常角质形成细胞PD-L1及关键信号因子如Oct-1,p-p65等的表达水平。 3.通过免疫组化、免疫荧光双标等方法测定并比较白癜风患者白斑组织、正常对照皮肤中黑素细胞量、黑素细胞表达的PD-L1、CD8+T细胞量以及CD8+T细胞表面PD-1的表达水平。 4.分离白癜风患者及健康对照外周血中PD-1-及PD-1+CD8+T细胞亚群,检测并比较CD8/CD4比例,进一步比较白癜风患者CD8+T细胞PD-1-亚群及PD-1+亚群。 结果: 1.体外构建氧化应激模型的H2O2浓度筛选结果显示,400mM H2O2是体外黑素细胞氧化应激模型的最适浓度; 2.通过qRT-PCR检测技术显示,H2O2刺激显著抑制黑素细胞系Hemers中PD-L1的mRNA表达,氧化应激下,Oct-1在Hemers中mRNA水平显著降低; 3.通过western blot检测技术发现,体外H2O2刺激抑制黑素细胞系Hemers中PD-L1及其转录因子Oct-1表达水平; 4.细胞免疫荧光检测,在氧化应激条件下,黑素细胞系Hermes中PD-L1的表达有下调趋势,该结果与western结果一致; 5.流式检测显示,氧化应激对角质形成细胞系Hacat的细胞膜表面PD-L1的表达具有显著促进作用,而对正常黑素细胞系PIG1和Hemers则无明显的调控作用。 6.通过免疫组化的方法,对比正常人组织与白癜风患者皮损组织局部PD-L1的表达水平及分布。结果显示,正常人皮肤组织中PD-L1表达水平较低,且主要分布在细胞核中;白癜风患者皮损局部PD-L1的表达水平显著升高,且主要为角质形成细胞细胞浆和细胞膜有显著表达; 7.免疫荧光双标的方法,对黑素细胞和PD-L1同时进行标记。结果显示,白癜风患者皮损组织中黑素细胞数量明显减少,且黑素细胞中PD-L1的表达也显著低于正常皮肤组织。 8.通过流式检测进一步分析白癜风患者外周T淋巴细胞的比例以及其表面PD-1的表达水平。结果显示,与健康对照相比,白癜风患者外周血中CD8/CD4比例明显升高;对CD8+T细胞进一步分析,发现白癜风患者CD8+PD-1-T细胞占CD8+T细胞的比例也显著升高。 9.免疫荧光双标的方法对白癜风患者皮损组织中浸润CD8+T表面的PD-1表达进行了检测,发现正常组织中几乎无淋巴细胞浸润,而进展期白癜风患者皮损处可见大量CD8+T细胞浸润;进一步分析双标结果,发现组织中大部分的CD8+T细胞均未检测到明显的PD-1表达。 结论: 通过本课题研究,证实了氧化应激下白癜风患者黑素细胞中PD-L1的表达水平降低,同时白癜风患者CD8+T细胞表面PD-1的表达也下降,使得PD-L1/PD-1信号通路受到抑制,进而促进CD8+杀伤性T细胞杀伤活性,增强其对黑素细细胞的杀伤作用。明确了Oct-1信号分子在PD-L1/PD-1信号通路中发挥作用,初步探究了PD-L1/PD-1信号通路在白癜风的相关机制。