第一部分PEDF/PEDF-R在正常母胎界面的表达及生物学功能[目的]研究正常妊娠妇女pNK细胞、dNK细胞、DSCs表达PEDF的情况,探究PEDF-R在正常早孕蜕膜组织和DSCs上的分布情况及PEDF在母胎界面的生物学功能。[方法]本研究利用流式细胞术检测正常妊娠妇女pNK细胞、dNK细胞、DSCs中PEDF表达情况;检测pNK细胞,及与DSCs和或HTR-8/SVneo细胞(永生化的人绒毛外滋养层细胞系)共培养情况下PEDF表达水平的变化;分析rhPEDF和正常dNK细胞分泌的PEDF对由LPS介导的DSCs凋亡及炎症反应的影响。用免疫组化和Western blot检测蜕膜组织及DSCs上PEDF-R的表达情况。[结果](1).大约80%的dNK细胞胞内表达PEDF,而只有约50%的pNK细胞胞内表达PEDF,差异具有统计学意义(P<0.01)。(2)将pNK细胞与DSCs或HTR-8/SVneo细胞或三种细胞共同培养,结果显示,与单独pNK细胞组比较,三种细胞共培养组和两种细胞共培养组中,pNK细胞胞内PEDF的表达水平均显著增加,差异具有统计学意义(P值均<0.01)。(3)用免疫组化检测发现正常蜕膜上有PEDF-R的表达,并通过Western blot验证了 PEDF-R表达在正常蜕膜的DSCs上。用流式细胞术进行检测,发现与正常dNK细胞相比,DSCs几乎不分泌任何PEDF,具有统计学意义(P<0.001)。(4)将rhPEDF预处理DSCs,12h后用LPS处理该细胞,流式结果显示加入LPS后,DSCs的总凋亡细胞比例上升,而rhPEDF预处理组总凋亡细胞比例则明显下降,差异具有统计学意义(P<0.001)。继而用三种不同的质粒沉默DSCs上的PEDF-R,并选择具有最佳沉默效应的质粒sh-PEDF-R3用于随后的实验。流式结果显示加入LPS后,DSCs总凋亡细胞比例上升,加入来自正常早孕妇女的dNK细胞培养上清液后,DSCs总凋亡细胞比例下降,而沉默PEDF-R后凋亡细胞比例上升,明显高于阴性质粒对照组,差异具有统计学意义(P值均<0.01)。(5)将rhPEDF预处理DSCs,12h后用LPS处理该细胞,LPS处理后TNF-α+DSCs细胞比例上升,而rhPEDF预处理后TNF-α+DSCs细胞比例下降,差异具有统计学意义(P<0.01),而对IL-1β、IL-8、IL-17A则没有显著影响(P值均>0.05)。我们将正常妊娠妇女的dNK细胞培养上清液加入PEDF-R敲低的DSCs与对照组DSCs培养体系中,结果显示LPS处理后TNF-α+DSCs细胞比例升高,正常dNK细胞收集的培养上清液预处理组TNF-α+DSCs细胞比例下降,且接近rhPEDF预处理组,而相比于阴性质粒对照组,DSCs上的PEDF-R沉默组TNF-α+DSCs细胞比例则明显上升,差异具有统计学意义(P值均<0.01)。相同的方法检测DSCs分泌的IL-1β、IL-8、IL-17A,其水平没有显著变化(P值均>0.05)。[结论](1)与pNK细胞相比,正常早孕妇女dNK细胞表达PEDF明显增高,且可能与蜕膜局部微环境有关。(2)正常蜕膜和DSCs上表达PEDF-R,但DSCs上不表达PEDF。(3)dNK细胞产生的PEDF可能通过与PEDF-R的相互作用抑制LPS诱导的DSCs凋亡和炎症损伤。第二部分PEDF在母胎界面发挥生物学功能的机制[目的]分析PEDF在母胎界面保护DSCs免受LPS诱发损伤的信号通路机制。[方法]利用Western blot检测MAPK家族成员(ERK1/2和P38)、STAT家族成员(STAT6)、IκB、NF-κB蛋白水平变化,用流式细胞术进一步分析PEDF发挥生物学功能的信号通路。[结果](1)我们通过Western blot检测了 MAPK家族成员(ERK1/2和P38)和STAT家族成员(STAT6)。结果显示LPS的使用显著降低了 ERK1/2的磷酸化,并且这种作用通过预先加入rhPEDF而减弱。LPS刺激导致磷酸化的IκB和磷酸化的NF-κB的蛋白水平上调,而rhPEDF预处理后则显著抑制LPS引起的这些磷酸化蛋白水平的上调。Western blot未检测到P38和STAT6蛋白水平的变化。(2)使用了特异性信号转导抑制剂阻断相应信号通路观察DSCs凋亡比例变化,结果显示LPS刺激后DSCs总凋亡比例明显升高,rhPEDF预处理组该比例则下降,而用SCH772984(ERK1/2抑制剂)阻断ERK1/2信号通路后总凋亡比例又上升,差异具有统计学意义(P值均<0.05);而加入CAPE(NF-κB抑制剂)组的DSCs总凋亡比例与单独加入LPS组相比没有差异,没有统计学意义(P>0.05)。(3)同样使用特异性信号转导抑制剂观察DSCs分泌炎症因子的变化,结果显示LPS刺激后DSCs分泌TNF-α水平明显升高,rhPEDF预处理组该细胞因子水平则下降,差异具有统计学意义(P值均<0.01);而用SCH772984阻断ERK1/2信号通路后TNF-α分泌水平与rhPEDF预处理组没有明显变化,没有统计学意义(P>0.05)。但是加入CAPE组的DSCs表达TNF-α水平与单独加入LPS组相比则有明显的下降,差异具有统计学意义(P<0.001)。[结论]PEDF可能通过激活ERK1/2信号通路减少细胞凋亡,而通过抑制DSCs中的NF-κB信号通路减少炎症因子的分泌。第三部分流产妊娠妇女母胎界面PEDF/PEDF-R的异常表达及其对DSCs的影响[目的]比较正常妊娠妇女dNK细胞和流产妊娠妇女dNK细胞PEDF表达水平的差异,探究正常蜕膜组织、DSCs和流产蜕膜组织、DSCs表达PEDF-R的情况及正常dNK细胞与流产dNK细胞在生物学功能上的差异。[方法]用流式细胞术和Western blot检测正常妊娠妇女和流产妊娠妇女dNK细胞中PEDF的表达情况。用免疫组织化学技术及Western blot检测正常蜕膜组织、DSCs与流产蜕膜组织、DSCs上PEDF-R的表达情况。用流式细胞术分析正常dNK细胞与流产dNK细胞分泌的PEDF在生物学功能上的差异。[结果](1)采用流式细胞术和Western blot进行检测,流式结果显示约80%的正常早孕dNK细胞表达PEDF,而仅45%左右的流产早孕妇女dNK细胞表达PEDF。Western blot结果显示正常早孕妇女组dNK细胞表达的PEDF条带比流产早孕妇女组PEDF条带更明显,差异具有统计学意义(P值均<0.001)。(2)采用Western blot检测正常怀孕或流产妇女DSCs上PEDF-R的表达,结果显示在蛋白水平上,流产妇女组在55kDa处几乎看不到PEDF-R条带,而正常早孕妇女组则能明显观察到PEDF-R条带,定量分析也表明流产早孕妇女DSCs上的PEDF-R表达水平比正常早孕妇女显著下降,差异具有统计学意义(P<0.001)。同时,IHC也检测到与正常早孕组比较,流产早孕组DSCs上的PEDF-R表达水平下降,与Western blot结果一致。(3)功能学实验结果显示加入LPS后DSCs的总凋亡比例上升,预先加入正常妊娠妇女的dNK细胞培养上清液(NP-sNK)后,DSCs的总凋亡比例下降,而妊娠异常妇女的dNK细胞培养上清液(AP-sNK)预处理组DSCs的总凋亡比例比NP-sNK预处理组高,差异具有统计学意义(P值均<0.05)。(4)流式结果显示加入LPS后DSCs分泌的TNF-α明显增高,NP-sNK预处理组DSCs分泌的TNF-α阳性比例下降,而AP-sNK预处理组,DSCs分泌的TNF-α阳性比例高于NP-sNK预处理组,差异具有统计学意义(P值均<0.01)。[结论](1)流产dNK细胞表达PEDF明显低于正常dNK细胞的表达。流产早孕组蜕膜组织、DSCs上的PEDF-R表达水平也相应下降。这表明PEDF/PEDF-R表达的下降可能与自然流产有关。(2)相比于正常dNK细胞上清液,流产dNK细胞上清液发挥抗炎及抗凋亡能力减弱。这表明在流产中,dNK细胞由于PEDF/PEDF-R下调表达,从而发挥抗炎及抗凋亡能力减弱。我们推测dNK细胞及其分泌的PEDF可能对维持正常妊娠至关重要。