研究目的：　　卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)通常是指女性在于40岁以前出现闭经，伴随着持续雌激素水平降低和促性腺激素水平的升高等内分泌紊乱。全球范围内的流行学调查显示，POF的发病率为1-2％，但有逐年增高的趋势。目前，大部分POF患者的病因是不明确的，对于无生育要求的患者，激素替代治疗可缓解她们提前出现的更年期症状。然而在那些尚未生育或仍有生育需求的患者中，由于常规的辅助生殖技术难以获得成熟高质量的卵子，因此无法发挥相应作用，这也成为POF辅助生殖治疗最为棘手的难题。　　对于大部分POF患者来说，赠卵的体外受精-胚胎移植技术是最为有效的办法，但因法律、伦理和人们思想观念的限制，难以满足POF患者的生育需求。有研究显示，大部分POF患者卵巢皮质内仍残存一些处于休眠状态的始基卵泡，但是这部分卵泡对促性腺激素无反应能力，故无法正常发育、成熟。如何保存这部分可能存在潜在生育功能的始基卵泡并激活使其生长发育，获得有效卵子成为POF患者辅助生殖治疗新的突破口。　　现阶段，生育力保存的常用方法有胚胎冷冻、卵母细胞冷冻、卵母细胞体外成熟和卵巢组织冷冻等。然而，对于POF患者来说，无法获得成熟或未成熟的卵子，更无法应用成熟的卵子在体外与精子受精形成胚胎，故胚胎冷冻、卵母细胞冷冻和卵母细胞体外成熟的方式无法成为POF患者保存生育力的方法。这使得卵巢组织冷冻技术成为POF患者保存生育力的仅存方式。卵巢组织冷冻可分为玻璃化冷冻和慢速程序化冷冻两种方式。越来越多的研究显示玻璃化冷冻技术较传统的慢速冷冻更为简单、高效。　　近年来，如何激活休眠状态的始基卵泡成为POF生殖治疗的研究热点。因体内应用激活剂存在肿瘤发生的风险，故更多研究将将目光聚焦于体外激活。体外激活(invitro activation)技术是将卵巢组织从患者体内取出，进行一定的处理或使用激活剂，激活卵巢组织中处于休眠状态的卵泡继续发育，再将卵巢组织移植回患者体内，以期获得成熟卵泡并妊娠。卵巢组织体外培养的实验显示，PTEN抑制剂可使用的激活PI3K-AKT信号通路，激活始基卵泡的发育，人卵巢组织异种移植的研究同样证实了该作用。Hippo信号通路在哺乳动物体内也广泛存在，且高度保守，其主要功能为限制组织器官过度生长。日本有学者研究发现将小鼠卵巢片段化处理为小的卵巢组织块可阻断体内Hippo信号通路，促进卵泡发育。　　本研究通过对人卵巢组织进行玻璃化冷冻及复苏，评价玻璃化冷冻及复苏对卵巢组织冷冻的有效性。并对人卵巢组织进行片段化处理，检测Hippo信号通路中YAP、pYAP蛋白及CCN生长因子、BIRC凋亡抑制因子的含量变化，证实是否对人卵巢片段化处理后可阻断Hippo信号通路。将片段化处理后的卵巢组织体外加入AKT刺激物培养后进行裸鼠背阔肌移植，探究是否可体外激活卵泡发育。　　研究方法：　　本课题研究中，我们收集了本院整形科易性病患者（女变男）及妇产科非卵巢因素行卵巢切除术的患者卵巢组织，进行玻璃化冷冻，一段时间后对冷冻的卵巢组织进行解冻复苏，并利用组织HE染色的方法比较冷冻前后卵巢组织形态学改变。接着，我们对复苏后的卵巢组织进行片段化处理，利用免疫组化，比较处理前后YAP蛋白定位变化及CCN3表达量的改变，利用RNA抽提，反转录及qPCR技术比较片段化处理后不同时间点CCN及BIRC的表达水平，并运用Western blotting在蛋白水平检测YAP及CCN3的表达情况。同时，将片段化处理后的卵巢组织加入AKT刺激物进行体外培养，培养后的卵巢组织进行裸鼠背阔肌移植，检测卵泡发育情况。　　研究结果：　　1.卵巢组织玻璃化冷冻前后无明显形态学改变。　　在对玻璃化冷冻前后卵巢组织HE染色形态学比较中，冷冻前后卵巢组织内均可见卵巢间质细胞呈梭形排列，前内可见散在分布的始基卵泡，始基卵泡内卵母细胞可见细胞核清晰，呈圆形，卵母细胞周围包绕一层梭形前颗粒细胞，冷冻复苏后的卵巢组织HE染色后可见镜下形态与冷冻前新鲜卵巢组织无明显改变。　　2.片段化处理人卵巢组织可降低p-YAP蛋白含量，颗粒细胞细胞核中YAP蛋白含量增多。　　本研究将解冻复苏后的卵巢组织进行片段化处理，对处理前后卵巢组织内YAP蛋白及p-YAP蛋白含量进行western blotting检测，结果示处理后1小时卵巢内p-YAP蛋白含量较处理前明显降低，YAP蛋白无明显改变，p-YAP/YAP明显降低。同时，对片段后处理后的卵巢组织进行YAP蛋白的免疫组化检测，比较YAP蛋白定位变化，可见片段化处理后的卵巢组织内可见颗粒细胞核内YAP蛋白含量增多。　　3.片段化处理人卵巢组织片后CCN生长因子及BIRC凋亡抑制因子表达量增加。　　本研究将解冻复苏后的卵巢组织进行片段化处理，利用RNA抽提，反转录及q-PCR技术比较片段化处理后不同时间点CCN及BIRC的表达水平，结果显示片段化处理后CCN2、CCN3、BIRC1、BIRC7表达量均上升，有统计学意义。western blotting检测CCN3蛋白水平变化，提示片段化处理后CCN3蛋白水平明显增高。同时，我们还用运免疫组化的方法检测CCN3表达变化，结果提示CCN3表达量较处理前明显增高。　　4.将片段化处理后的卵巢组织运用AKT刺激物体外培养后可增加p-AKT表达量，裸鼠背阔肌移植未见明显坏死。　　本研究通过对片段化处理后的卵巢组织运用AKT刺激物体外培养，利用westernblotting检测p-AKT蛋白水平变化，结果显示运用AKT刺激物培养后的卵巢组织内p-AKT蛋白表达量明显增高。将培养后的卵巢组织移植入裸鼠背阔肌，一段时间后回收卵巢组织进行HE染色发现，可见新生血管，无明显坏死。　　研究结论：　　1.卵巢组织玻璃化冷冻可作为生育力保存的有效方法;　　2.片段化处理人卵巢组织可阻断Hippo信号通路;　　3.加入AKT刺激物进行卵巢组织体外培养可增加p-AKT表达量;　　4.人卵巢组织片段化处理联合AKT刺激物处理后裸鼠移植可以存活。