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研究背景和目的目前宫颈癌的发病率及死亡率居我国妇科恶性肿瘤第一位。包括组蛋白乙酰化在内的基因表观遗传修饰异常是宫颈癌发生发展的重要因素。参与组蛋白乙酰化的赖氨酸乙酰转移酶(lysine acetyltransferases,KATs)对染色体的结构和功能至关重要。在编码KATs的基因中,KAT6B是一个非常重要的肿瘤驱动基因,其扩增在多种肿瘤中发现,比如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肠癌等。也有研究发现KAT6B具有抑癌基因的作用。目前,KAT6B的有关研究较少,其对宫颈癌恶性生物学行为的作用及分子机制尚未明确。本项目拟运用分子、细胞生物学等方法,研究KAT6B在宫颈癌发展中的作用及相关信号机制。进一步研究KAT6B在宫颈癌患者中表达及对临床预后的影响。探讨宫颈癌治疗新的潜在靶点(KAT6B-AMPKα)。研究方法及材料首先,收集江苏大学附属昆山医院手术切除的未做任何放疗、化疗的新鲜原发宫颈癌标本6例,运用PCR和/或western blot方法检测宫颈癌组织中KAT6B、AMPKα表达。随后,人宫颈癌Hela、C33a细胞株(购自上海生命科学研究院),分别转染si RNA、CRISPR/Cas9-KO及过表达(over expression)KAT6B病毒,建立不同KAT6B表达、稳转的宫颈癌细胞株。显微镜下每日记录固定视野细胞数量、克隆形成实验检测各组细胞生长;EdU实验检测细胞增殖;细胞周期由流式细胞仪检测;细胞迁移由划痕实验、transwell实验检测;细胞侵袭能力由Matrigel transwell实验检测。Western blot检测KAT6B、AMPKα、磷酸化AMPKα、磷酸化AKT及m TOR、S6和磷酸化S6蛋白表达,并检测相关生长因子受体EGFR、PDGFRα、PDGFRβ等蛋白的表达变化。最后,收集江苏大学附属昆山医院活检及手术切除的未做任何放疗、化疗的宫颈癌标本(新鲜及石蜡包埋)119例,取手术周边正常组织(35例)作为对照。宫颈癌及正常宫颈组织中KAT6B表达由免疫组化方法检测,并分析其与宫颈癌各临床指标的相关性,包括病理类型、分期、分级、预后。进一步研究KAT6B在宫颈癌发展中的作用。实验操作中细胞种板的数量、试剂的浓度及具体实验方法基于发表文献和预实验的结果。统计学处理在细胞学实验中,至少设置3个副孔,每个实验重复≥3次。分析统计及作图使用SPSS 22.0及Graph Pad prism 7.0软件,并运用one-way ANOVA,Scheffe和Tukey检验、Chi-square检验、Kaplan-Meier法、COX回归分析等方法分析实验数据。有统计学意义的判定标准:P<0.05。研究结果1.宫颈癌组织KAT6B相比癌周围正常组织表达增加。收集江苏大学附属昆山医院手术切除的未做任何放疗、化疗的新鲜原发宫颈癌标本6例,PCR检测组织中KAT6B mRNA,结果发现宫颈癌组织中KAT6B mRNA水平较周围正常组织明显增加。宫颈癌组织中KAT6B、EGFR、PDGFRα蛋白表达明显增加。AMPKα则较正常组织相比减少,但无统计学意义。2.KAT6B促进宫颈癌细胞生长、增殖、迁移、侵袭。建立不同KAT6B表达、稳转的宫颈癌细胞株。之后对各组细胞连续6天计数,记录其生长情况。下调KAT6B减慢细胞增殖速度,细胞增殖明显抑制是从第四天开始。细胞克隆实验、EdU实验也提示下调KAT6B细胞增殖速度下降。而KAT6B上调,促进宫颈癌细胞生长、增殖。划痕实验、transwell、Matrigel transwell实验提示抑制KAT6B后,细胞迁移、侵袭能力明显抑制,而KAT6B过表达组均出现促进迁移、侵袭的结果。3.KAT6B促进细胞分裂增殖。敲低或敲除KAT6B后,细胞处于G0/G1期数量增多、处于S期明显减少。而KAT6B过表达的宫颈癌细胞株则出现相反的结果,G0/G1期细胞减少,处于DNA复制的S期细胞明显增多。4.KAT6B抑制AMPKα信号通路。western blot结果表明,KAT6B下调的宫颈癌细胞KAT6B表达减少,磷酸化的AMPKα表达增加,并且磷酸化的m TOR、AKT、S6表达也减少。EGFR、PDGFRα、PDGFRβ这些酪氨酸激酶受体也发现表达减少。而KAT6B过表达的细胞中则出现相反的结果。5.KAT6B高表达是宫颈癌的不良预后因素。在两种组织细胞浆、细胞核中均检出KAT6B表达。其中宫颈癌KAT6B高表达为30.43%(胞浆)、33.91%(胞核),差异无统计学意义。正常宫颈KAT6B高表达占2.94%(胞浆)、23.53%(胞核),差异有统计学意义。运用Kaplan-Meier方法分析发现KAT6B高表达(胞浆/胞核)宫颈癌患者总生存期(Overall Survival,OS)、无病生存期(Progression Free Survival,PFS)明显缩短。单因素及COX回归方法分析KAT6B表达与临床指标的相关性,提示FIGO分期、高KAT6B表达是OS的独立预后因素(FIGO分期:HR 3.531,95%CI1.763-7.071,p<0.05;胞浆KAT6B:HR 2.949,95%CI 1.443-6.025,p<0.05;胞核KAT6B:HR 2.529,95%CI 1.248-5.128,p<0.05),亦是PFS的独立预后因素(FIGO分期:HR 3.531,95%CI 1.763-7.071,p<0.05;胞浆KAT6B:HR 2.968,95%CI 1.541-5.713,p<0.05;胞核KAT6B:HR 2.529,95%CI 1.321-4.816,p<0.05)。结论1.宫颈癌组织中KAT6B表达增加,EGFR、PDGFRα蛋白也相应的表达增加,KAT6B可能是促进宫颈癌增殖的因素之一。AMPKα则较正常组织相比减少(p>0.05)。2.下调KAT6B后宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭能力均明显下降,而KAT6B过表达的宫颈癌细胞则表现出相反的结果。KAT6B在宫颈癌增殖、迁移、侵袭中具有重要作用。3.宫颈癌KAT6B抑制AMPKα激活,伴随多种酪氨酸激酶受体表达增加,并激活AKT-m TOR信号通路,这可能是KAT6B促进宫颈癌增殖的信号机制。4.宫颈癌KAT6B表达增加,且胞浆与胞核表达无明显差异。宫颈癌KAT6B表达与年龄、FIGO分期、淋巴结相关,不同病理类型、肿瘤分级的宫颈癌中表达无明显差异。KAT6B高表达患者预后较差,有更短的OS及PFS。COX分析发现FIGO分期、KAT6B表达为OS、PFS的独立预后因素。