目的:自然杀伤（Natural killer,NK）细胞连接先天性和适应性免疫应答,在早期抗肿瘤、抗病毒及免疫调节中发挥着至关重要的作用。NK细胞的活化及发挥功能由细胞表面表达多种受体传递的活化或抑制性信号之间的动态平衡进行调控。在肿瘤或慢性病毒感染等病理情况下,免疫细胞会通过上调免疫调控受体的表达,启动多种抑制性信号以防止免疫细胞的过度活化,而高表达的免疫调控受体介导的抑制性信号使细胞效应功能降低进而发展为耗竭状态。近年来,淋巴细胞活化基因3（Lymphocyte activation gene 3,LAG3）作为一种新型免疫调控受体被学者们关注。LAG3与相应配体结合后,发挥负向免疫调节作用,对免疫自稳及免疫细胞效应功能产生影响,且与多种肿瘤、自身免疫性疾病、慢性炎症等疾病的发生、临床转归密切相关。然而目前在HIV感染中NK细胞及各亚群表面LAG3的表达情况、与HIV疾病进展的关系、对NK细胞功能的影响,以及LAG3通过何种信号机制影响细胞功能均未见报道。本研究旨在明确HIV感染者NK细胞及各亚群表面LAG3的表达情况与疾病进展指标的相关性、异常表达LAG3与NK细胞功能耗竭之间的联系,并通过对激活LAG3的NK细胞进行转录组测序分析,探究LAG3影响NK细胞功能的具体信号机制,为HIV感染的免疫治疗提供新思路和潜在目标。研究方法:1.研究对象:本研究招募HIV感染者共141例,其中包括25例未治疗感染者和116例接受抗逆转录病毒治疗的感染者,以及54例HIV阴性且无其他相关疾病的健康对照者。2.提取及分选细胞:采用密度梯度离心法提取外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）,用以下一步流式染色、细胞培养及NK细胞分选。NK细胞分选使用Stemcell公司的NK细胞分选试剂盒进行磁珠负选并用于后续实验。3.NK细胞表面标志物检测:对新鲜提取的PBMCs进行表面染色:CD3-FITC、CD14-Per CP、CD19-Per CP、CD16-APC-Cy7、CD56-PE-Cy7、LAG3-PE、LAG3-BV421、NKG2C-APC、CD38-BV421、HLA-DR-APC、CD69-PE、Glut-1-PE。使用BD FACS Canto II流式细胞仪检测NK细胞表面LAG3、NKG2C、CD38、HLA-DR、CD69及Glut-1的表达情况。4.NK细胞核内Ki67表达检测:对PBMCs进行表面染色后,用Thermo Fisher公司的破核试剂进行破核,随后进行核内标志物Ki67的染色,使用BD FACS Canto II流式细胞仪检测NK细胞核内Ki67表达情况。5.NK细胞产生IFN-γ能力检测:PBMCs用10 ng/m L IL-12、50 ng/m L IL-15和100 ng/m L IL-18的细胞因子混合物刺激培养24 h后,收集细胞加入Fixable Viability Stain 620进行死活染色,然后进行表面染色,破膜剂处理使细胞透化后进行胞内IFN-γ的染色,使用BD FACS Canto II流式细胞仪检测分析NK细胞产生IFN-γ能力。6.封闭LAG3配体实验:PBMCs用2μg/m L LAG3 Fc或2μg/m L Ig G1 Fc培养细胞24 h后,对NK细胞表面标志物CD69、HLA-DR、NKG2C、CD38及核内Ki67进行检测;PBMCs用2μg/m L LAG3 Fc或2μg/m L Ig G Fc预先培养2 h后,进行细胞因子混合物刺激培养及NK细胞产生IFN-γ能力检测。7.2-DG、外源性葡萄糖对NK细胞功能影响的检测:PBMCs用5 mmol/L 2-DG、10 mmol/L葡萄糖预处理细胞2 h后,进行细胞因子混合物刺激培养及NK细胞产生IFN-γ能力的检测。8.NK细胞胞内磷酸化标志物检测:分选出的NK细胞经预处理后用细胞因子混合物刺激15 min,随后立即使用BD公司Fix Buffer I和Perm Buffer III处理细胞,进行磷酸化染色:AKT-FITC、m TOR-PE、S6-APC、total STAT1-APC,使用BD FACS Canto II流式细胞仪检测NK细胞胞内AKT、m TOR、S6及STAT1的磷酸化情况。9.LAG3激活实验:分选出的NK细胞用5μg/m L anti-LAG3、10μg/m L anti-LAG3、20μg/m L anti-LAG3或10μg/m L anti-Ig G预处理2 h后,进行细胞因子混合物刺激培养及NK细胞表面Glut-1、核内Ki67及产生IFN-γ能力检测;用10μg/m L anti-LAG3及10μg/m L anti-Ig G预处理细胞2 h后,进行NK细胞胞内磷酸化标志物检测;10μg/m L anti-LAG3及10μg/m L anti-Ig G预处理细胞24 h后收集细胞外送进行转录组测序。10.转录组测序分析:转录组测序使用华大基因公司的DNBSEQ平台。通过RSEM计算基因的表达量。使用Q≤0.05的DESeq2进行差异表达分析,采用phatmap以及R语言Complex Heatmap包绘制热图。利用Phyper进行KEGG通路和GO生物学过程富集分析。基因集富集分析使用GSEA v3.0软件,富集通路数据集使用GSEA MSig DB数据库中的H（hallmark）、C5（GO）biological processes数据集,一般认为满足False discovery rate（FDR）＜0.25且p-value＜0.05即为显著富集。11.统计学分析:使用Flow Jo software 10.5.3对流式细胞仪所得结果进行分析作图。使用Graph Pad Prism 8.0和SPSS 26.0软件对实验结果进行作图及统计学分析。配对t检验用于两组符合正态分布的配对数据的差异分析;对于不符合正态分布的数据,Mann-Whitney U检验用于两组数据之间的差异分析,Wilcoxon配对检验用于两组配对数据的差异分析,Spearman检验用于分析两指标之间的相关性,检验均为双侧检验,p＜0.05认为差异存在统计学意义。结果:1.免疫调控受体LAG3在HIV感染者NK细胞及各亚群表达明显升高LAG3在HIV感染者外周血总NK细胞表面的表达明显高于健康对照者（%:p=0.0025;MFI:p=0.0013）,与未治疗感染者相比,ART治疗后LAG3表达显著下降（%:p＜0.0001;MFI:p＜0.0001）。HIV感染者NK细胞三个亚群表面LAG3表达均明显高于健康对照者,ART治疗后LAG3表达明显下调。HIV感染者中LAG3在CD56bright NK细胞上表达最高,在CD56-CD16+NK细胞上表达最低。2.LAG3表达与HIV感染者CD4+T细胞绝对计数、CD4/CD8比值及病毒载量的相关性HIV感染者总NK细胞表面LAG3表达与CD4+T细胞绝对计数（%:r=-0.3455,p=0.0121;MFI:r=-0.3246,p=0.0189）和CD4/CD8比值（%:r=-0.4803,p=0.0003;MFI:r=-0.4308,p=0.0014）均呈现出明显负相关性。未接受ART治疗的HIV感染者NK细胞表面LAG3表达与病毒载量无明显相关性。NK细胞各亚群中LAG3表达百分比均与CD4+T细胞绝对计数、CD4/CD8比值呈明显负相关性。3.与LAG3-NK细胞相比,LAG3+NK细胞功能下降HIV感染者NK细胞表面NKG2C、HLA-DR表达与LAG3的表达呈现负相关性（NKG2C:%:r=-0.5489,p=0.0297;MFI:r=-0.5843,p=0.0193;HLA-DR:%:r=-0.7000,p=0.0034）,CD38表达与LAG3呈正相关性（%:r=0.5147,p=0.0436;MFI:r=0.5941,p=0.0172）。与健康对照者相比,HIV感染者NK细胞产生IFN-γ受限（p=0.0411）。与LAG3+NK细胞相比,LAG3-NK细胞产生IFN-γ能力更强（p＜0.0001）。4.封闭LAG3配体后可明显恢复NK细胞功能重组LAG3-Fc处理后,HIV感染者NK细胞表面表达活化受体CD69和HLA-DR、核内表达增殖标志物Ki67以及产生IFN-γ能力均明显升高（CD69:p=0.0273;HLA-DR:p=0.0078;Ki67:p=0.0059;IFN-γ:p=0.0098）。5.激活LAG3后可明显抑制NK细胞功能特异性抗体anti-LAG3激活了LAG3的抑制作用,并以剂量依赖性的关系抑制NK细胞功能,NK细胞产生IFN-γ能力和增殖能力明显下降（IFN-γ:p=0.0391;Ki67:p=0.0049）。6.转录组测序显示LAG3抑制NK细胞糖酵解相关基因的表达对anti-LAG3和anti-Ig G抗体处理后的NK细胞进行转录组测序分析,发现调节糖酵解的关键基因MYC、糖酵解相关酶基因己糖激酶2（HK2）、磷酸果糖激酶血小板型（PFKP）、6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶1/4（PFKFB1/4）等在激活LAG3后表达显著下调。KEGG通路和GO生物学过程富集分析显示下调的差异表达基因显著集中在糖酵解/糖异生（Glycolysis/Gluconeogenesis）和糖酵解过程（glycolytic process）。GSEA分析显示糖酵解（Glycolysis）和6-磷酸果糖的糖酵解过程（Glycolytic process through Fructose-6-Phosphate）相关基因主要上调表达在对照组NK细胞上,提示LAG3激活后通过抑制MYC及多个糖酵解相关酶基因的转录进而下调NK细胞的糖酵解。7.体外实验证明LAG3通过PI3K/AKT/m TOR信号抑制NK细胞糖酵解进而影响细胞功能在体外激活LAG3后NK细胞表面Glut-1的表达明显下降（%:p=0.0015;MFI:p=0.0024）,胞内AKT、m TOR和S6磷酸化水平显著下调（p-AKT:p=0.0156;p-m TOR:p=0.0469;p-S6:p=0.0156）。2-DG抑制糖酵解后,NK细胞IFN-γ表达显著下降（p=0.0005）且外源性葡萄糖可部分恢复（p=0.0005）。无外源性葡萄糖存在时LAG3+NK细胞功能低于LAG3-NK细胞（p=0.0017）,给予外源性葡萄糖后LAG3+NK细胞受损的功能被逆转（p=0.0052）至与LAG3-NK细胞无显著差异,证明了激活LAG3通过抑制PI3K/AKT/m TOR信号调节的NK细胞糖酵解,进而促进了NK细胞功能耗竭。8.激活的LAG3通过上调表达PSAT1抑制STAT1/IFNG信号通路通过分析转录组测序结果发现磷酸丝氨酸转氨酶1（PSAT1）基因在激活LAG3后表达量上调（p=0.0015）,STAT1表达量明显下降（p=0.043）,NK细胞内STAT1的磷酸化水平受到抑制（p=0.0078）,提示激活LAG3使PSAT1过表达,通过STAT1/IFNG信号通路抑制NK细胞产生IFN-γ的能力。结论:1.LAG3在HIV感染者的总NK细胞及各亚群表面表达明显升高,感染者ART后表达降低,且LAG3表达水平与HIV感染者CD4+T细胞绝对计数、CD4/CD8比值呈负相关。2.HIV感染后NK细胞表面高表达的LAG3可以抑制NK细胞表面活化受体的表达以及分泌IFN-γ的能力,封闭LAG3配体后NK细胞增殖、活化及IFN-γ的产生明显上调。3.激活LAG3可明显抑制NK细胞增殖和分泌IFN-γ的能力,且LAG3通过抑制PI3K/AKT/m TOR信号调节MYC及多个糖酵解相关酶基因的转录下调糖酵解,NK细胞糖酵解被抑制后其IFN-γ产生能力明显下降,并且可以被外源性葡萄糖恢复。4.激活LAG3可以上调表达PSAT1,同时抑制表达STAT1进而限制NK细胞产生IFN-γ。这些结果为研究LAG3对NK细胞代谢及功能耗竭产生的影响提供了新的线索,也为治疗HIV提供新的潜在目标。