目的：前期研究证实香加皮杠柳苷(CPP)具有抗肿瘤及免疫调节作用。同化学合成药物相比，天然中药活性物质具有结构新颖、活性高、副作用少的特点，其抗肿瘤机制往往是多环节、多途径、多靶点。杠柳苷在发挥其抗肿瘤效应的过程中，是否对癌细胞内异常表达和活化的STAT5信号通路产生影响值得探讨。 RNA干扰(RNAi)是指在生物体细胞内，外源性或内源性的双链RNA所引起的序列特异性基因沉默。小干扰RNA(siRNA)在肿瘤治疗领域方面的研究表明，使用siRNA特异地剔除肿瘤细胞内高表达的癌基因或者抗凋亡基因，可以抑制肿瘤的生长，诱导肿瘤细胞凋亡，增加放疗、化疗的敏感性。因此，设想CPP联合RNAi技术特异性下调肿瘤细胞内过度激活的STAT5后，可能提高CPP的抗肿瘤效应。 基于上述思考，本研究旨在①探讨人肝癌细胞株SMMC7721细胞中STAT5的表达及酪氨酸磷酸化情况；②构建以STAT5为靶向的RNA干扰重组质粒，沉默人肝癌SMMC7721细胞内STAT5基因的表达，并加以CPP药物干预，通过体内、体外实验，观察其抗肿瘤效应及对STAT5信号通路的影响，进一步揭示CPP及RNAi的抗肿瘤分子机制；③观察CPP及RNAi这两种目前被认为毒副作用较小的肿瘤治疗方法联合使用后是否产生更为显著的抗肿瘤效应，从而为建立新的肿瘤治疗策略提供理论和实验依据。 方法： 1. STAT5在人肝癌SMMC7721细胞内的表达 应用Westernblot、流式细胞术(FCM)方法分析人肝癌细胞株SMMC7721细胞、K562细胞、小鼠肝癌H22细胞及小鼠乳腺癌HA8911细胞中STAT5的表达及酪氨酸磷酸化情况。 2. 靶向STAT5A的RNA干扰重组质粒的构建与功能鉴定 设计针对STAT5A的三个特异的cDNA序列及一个无关序列，构建三个特异性重组质粒载体及一个无效重组质粒载体，分别命名为Pgenesil-1-STAT5A1、Pgenesil-1-STAT5A2、Pgenesil-1-STAT5A3、Pgenesil-1-HK。方法如下：体外合成编码siRNA的DNA模板，与线性化的质粒连接，连接产物转化感受态细菌DH5α，提取质粒酶切鉴定并进行DNA测序。证实插入序列正确后，将重组质粒转染SMMC7721细胞，激光共聚焦显微镜下鉴定转染效率，应用Westemblot、RT-PCR筛选最有效抑制STAT5表达的质粒表达载体用于后续实验。 3. CPP及靶向STAT5的siRNA诱导人肝癌SMMC7721细胞凋亡的研究 A组：空白对照组，没有采取任何干预措施，实验时加入无牛血清的RPMI1640培养基: B组：HK质粒对照组，转染时加入Pgenesil-1-HK重组质粒； C组：RNAi组，转染时加入Pgenesil-1-STAT5A1质粒； D组：CPP组，加入CPP，使其终浓度为2.5μg/ml； E组：RNAi+CPP组，转染时加入Pgenesil-1-STAT5A 1质粒，同时加入CPP，使其终浓度为2.5μg/ml。 分成以上五个实验组，转染48h后，MTT法分析CPP及RNAi对SMMC7721细胞的增殖抑制作用；流式细胞术检测不同处理组肿瘤细胞周期和凋亡率：透射电镜观察细胞凋亡的超微结构。 4. CPP及靶向STAT5的siRNA对人肝癌SMMC7721细胞STAT5信号通路的影响应用Westemblot、RT-PCR检测方法3种不同处理组SMMC7721细胞STAT5信号通路相关分子JAK1、P-JAK1，STAT5、P-STAT5的变化。 5. CPP及靶向STAT5的siRNA对SMMC7721荷瘤裸鼠抑瘤作用及对STAT5信号通路影响的体外实验研究用无血清RPMI-1640液洗涤并将SMMC7721细胞密度调至1×107/ml，在裸鼠右侧背部皮下接种肝癌SMMC7721细胞2×106个(0.2ml)，建立SMMC7721荷瘤裸鼠模型，分为A:模型对照组、B:HK质粒对照组、C:RNAi组、D:CPP组、E:RNAi+CPP组五个不同处理组，每组5只。CPP组、RNAi+CPP组中，CPP腹腔给药10mg/kg/d，连续给药观察20d；RNAi组、RNAi+CPP组中瘤内注射20μg Pgenesil-1-STAT5A1质粒DNA，(HK质粒对照组瘤内注射Pgenesil-1-HK质粒)每2天1次，共10次，连续给药观察20d。观察裸鼠及肿瘤的生长情况，测定抑瘤率。摘取肿瘤组织，应用激光共聚焦显微镜观察质粒转染情况，应用流式细胞术检测CPP及RNAi对肿瘤细胞周期和凋亡的影响；RT-PCR、Westernblot及免疫组化分析JAK1-STAT5信号通路中的上游分子JAK1、p-JAK1，STAT5、p-STAT5及下游分子Survivin、bcl-2、Bax在mRNA及蛋白水平上的变化。免疫细胞化学分析CD34的表达，以微血管(microvessel，MV)计数表示。 结果: 1. 人肝癌细胞株SMMC7721 STAT5表达情况: 2. 重组质粒的构建: ①重组质粒鉴定 ②质粒转染 ③有效质粒筛选 3. CPP及RNAi诱导SMMC7721细胞凋亡情况 ①CPP对SMMC7721细胞的抑制作用 ②CPP及siRNA对SMMC7721细胞增殖活性的影响 ③CPP及RNAi对SMMC7721细胞周期及细胞凋亡的影响 ④凋亡细胞的超微结构 4. CPP及RNAi对SMMC7721细胞STAT5信号通路相关分子JAK1、STAT5、P-JAK1、P-STAT5表达的影响 5. 杠柳苷及RNA干扰对SMMC7721荷瘤裸鼠抑瘤作用及其机制的研究 ①CPP及RNAi对荷瘤裸鼠的抑瘤作用 ②质粒转染效果的观察 ③CPP及RNAi对SMMC7721移植瘤细胞周期及凋亡的影响 ④CPP及RNAi SMMC7721移植瘤细胞JAK、P-JAK、STAT5、P-STAT5的表达的影响 ⑤CPP及RNAi对SMMC7721移植瘤细胞Survivin、Bax、bcl-2表达的影响 ⑥SMMC7721移植瘤内微血管(microvessel，MV)计数 结论： 1. 通过筛选首次发现人肝癌细胞株SMMC7721存在STAT5蛋白的表达及磷酸化，提示STAT5的异常表达和活化可能与人肝癌的发生有关。 2. 首次成功构建靶向STAT5A的RNA干扰重组体，筛选出抑制STAT5效果较好的Pgenesil-1-STAT5A1质粒，为以STAT5为靶点的肝癌治疗后续实验研究奠定了基础。 3. 杠柳苷和靶向STAT5的siRNA均能够抑制SMMC7721肿瘤细胞的增殖并诱导凋亡，两者存在协同效应。与只用单一因素处理组比较，杠柳苷联合靶向STAT5能够更为显著地抑制SMMC7721肿瘤细胞的增殖，凋亡率明显上升。 4. 靶向STAT5的siRNA可明显下调SMMC7721细胞STAT5表达：CPP可下调JAK1、STAT5的磷酸化水平；RNAi与CPP共同作用可能通过同时下调了STAT5的表达及STAT5、JAK1磷酸化水平，从而影响STAT5信号通路，起到了促进SMMC7721肿瘤细胞凋亡的作用。 5. 体内实验证实了药物香加皮提取物CPP及RNAi技术的体内抗肿瘤效应，无明显毒副作用，与体外实验结果一致。通过药物CPP干预及RNAi技术可阻滞SMMC7721移植瘤细胞周期，诱导细胞凋亡，下调JAK-STAT信号通路中STAT5的表达及JAK、STAT5的磷酸化，调节STAT5的下游靶基因Survivin、bcl-2及Bax的表达，使反应血管生成能力的CD34表达降低，从而达到抑制肿瘤生长的目的。 6. 本研究结论证实了CPP及RNAi这两种目前被认为毒副作用较小的肿瘤治疗方法联合使用后将会产生更为显著的抗肿瘤效应，从而为将来的肿瘤治疗提供新的思路和实验依据。