喹赛多作为喹噁啉类药物的新品种,具有毒副作用小、安全性高、用药后吸收快、消除迅速、无残留等优点,还展示出显著的促生长功能和抗炎活性。为了能够更好的开发利用喹赛多,本实验室对其进行了各方面的实验研究,但是目前对于喹赛多的药理作用机制还不甚明了。本实验室于2008年通过差异显示技术,从喹赛多作用后的猪肝组织中,筛选得到了8个药理作用相关基因,其中包含了锌指蛋白(SZNF)。SZNF是CCHC型锌指蛋白家族成员,能够结合基因的mRNA,在转录后水平发挥转录调节作用。我们推测SZNF可能正是探索喹赛多药物作用机制的一个良好切入口,喹赛多能够通过SZNF的转录调控功能,影响细胞内相关基因的表达,从而展现其促生长功能和抗炎活性。因此研究SZNF可以展示喹赛多在分子水平上的作用路径、调控网络,还能为新药的研发利用、新机制的探索打下良好的理论基础。本实验室已经对SZNF进行了初步研究,但是对于喹赛多如何调控SZNF的表达,SZNF的生理功能和组织分布等问题仍不甚明了,本课题即针对这些问题设计实验进行研究,以探明SZNF介导的喹赛多药理作用分子机制和SZNF的生物学功能。1.PK-15细胞中喹赛多调控SZNF表达的相关信号通路为了探明PK-15细胞中喹赛多调控SZNF表达的分子机制,本课题首先对SZNF表达的相关信号通路进行了研究。实验采用RT-qPCR(Real-time quantitative PCR)技术,检测了喹赛多孵育PK-15细胞后SZNF表达的时效量效关系,发现喹赛多诱导SZNF的上调表达表现出低剂量长时效应和高剂量短时效应,在2μM喹赛多作用4h时SZNF mRNA水平最高。随后利用喹赛多和信号转导通路特异性抑制剂共同孵育PK-15细胞,通过RT-qPCR和Western Blot实验,确定了JNK、NF-κB和JAK2/STAT5B信号通路是喹赛多诱导SZNF表达的主要调控通路,而PI3K／Akt和P38信号通路起着辅助调控作用。在探索PK-15细胞SZNF表达调控通路的时空关系时发现：喹赛多孵育PK-15细胞1h时,TAK1/NF-κB和JAK2/STAT5B信号通路激活；2h时,除了上述两条信号转导通路,myD88／TAK1&ASK1／JNK&NF-κB信号通路和JAK2/PI3K/Akt/NF-κB信号通路也参与进来,协同将细胞信号传递入核,发挥上调SZNF表达的功能。2.猪原代肝细胞中喹赛多诱导SZNF表达的相关信号通路为了明确猪原代肝细胞中喹赛多诱导SZNF表达分子机理,本课题也对SZNF表达相关信号通路进行了研究。实验采用RT-qPCR技术,首先研究了猪原代肝细胞中喹赛多诱导SZNF表达的时效量效关系。结果表明：虽然两种细胞属于不同的组织器官,但是喹赛多诱导SZNF表达的变化趋势一致。随后采用RT-qPCR和Western Blot技术,检测了喹赛多和信号转导通路特异性抑制剂孵育猪原代肝细胞后SZNF及相关信号通路因子的表达水平,发现JAK2/STAT1、PI3K/Akt、TGF-β/Smad3和P38这四条通路是喹赛多诱导SZNF表达的主要调控通路,而JNK和NF-κB信号通路则起到辅助调控功能。在探索上述信号通路时空关系时发现：喹赛多孵育猪原代肝细胞0.5h后,JAK2/STAT1, JAK2/PI3K/Akt和PI3K/Akt这三条信号通路激活；1h时,TGF-β/Smad3, TGF-β/PI3K/Akt以及myD88/TRAF2/TAK1&ASK1/P38信号通路也受到喹赛多的诱导而活化,之后这些信号通路协同作用,共同参与喹赛多调控SZNF表达信号的传递,并在TGF-β/JNK1/2信号通路的辅助作用下,完成了对SZNF表达的调控。3.仔猪体内SZNF的mRNA组织表达谱为了探索SZNF在猪体内的组织分布情况,实验采用RT-qPCR技术,检测了仔猪体内各个组织中SZNF mRNA水平,绘制得到SZNF的组织表达谱。试验结果表明：SZNF在仔猪下丘脑、垂体和骨髓这三个中枢神经系统中表达量最高,其次在肾上腺等具有强大分泌功能的组织中也有较高表达丰度,而在肝脏、十二指肠、肾脏等组织中表达量较低。4. SZNF结合核酸序列的RIP-Seq研究为了探索SZNF能够结合的核酸序列和SZNF的生物学功能,实验采用RIP-Seq(RNA-binding protein immunoprecipitation-Sequence)技术,对SZNF结合核酸序列进行了高通量测序检测,并对测序结果进行了分析和验证。结果表明：在空白PK-15细胞中筛选到118个能与SZNF结合的差异基因,而在喹赛多作用下的PK-15细胞中筛选到87个；另外,喹赛多作用下与SZNF结合上调的差异基因有45个；相反,与SZNF结合下调的基因有93个。同时,通过对SZNF结合基序的检测,发现SZNF易于结合富含G或C／T的核酸序列。在挑选了12个差异基因进行RIP-Seq结果的RT-qPCR验证后,发现RIP实验具有可重复性,测序得到的数据可靠。随后在RIP-Seq差异基因的Go功能分析中,初步明确SZNF能够参与细胞增殖分化、炎症反应、细胞周期等生理过程；而喹赛多能够通过SZNF对MLXIP、CKS2等生长相关基因和LGALS3等炎性相关基因的转录后调控,发挥其抗炎活性和促生长功能。综上所述,本课题是首次在PK-15细胞和猪原代肝细胞上,对SZNF表达调控分子机理及其生物学功能进行实验研究；也是首次研究了SZNF的组织表达谱。实验证明不论在哪种细胞中,喹赛多诱导SZNF的表达均受到JAK/STAT信号通路的调控；SZNF在中枢神经系统和具有强大分泌功能的组织中高表达；SZNF可以通过结合靶基因的mRNA,参与增殖分化、炎症反应等生理过程。另外,本课题也是首次在PK-15和猪原代肝细胞上,以SZNF作为切入口,对喹赛多的药物作用分子机制进行研究。实验表明：喹赛多可以通过诱导SZNF的表达,在转录后水平上,上调SZNF靶基因MLXIP、CKS2等的表达水平,同时抑制Bax、TMSB10等基因的表达,最终发挥喹赛多的药理活性。