目的:　　1.观察锌指E结合蛋白1(Zinc Finger E-Box-Binding Protein1，Zeb1)在肢芽间充质干细胞中特异性过表达对软骨发育的影响并探讨其调控机制。　　2.观察温肾阳方在胚胎期软骨生成中的作用，初步揭示温肾阳方在早期骨发育中的作用及相关调控机制，从骨发育的角度丰富“肾主骨”的理论内涵。　　方法:　　1.①在体内试验中，将Prx1-Cre转基因小鼠与Zeb1(stop)fx小鼠进行交配，获得Prx1-Cre; Zeb1(stop)fx胚胎，即在肢芽间充质干细胞特异性过表达Zeb1的实验组胚胎，同窝Prx1-Cre胚胎作为对照组。分别取E14.5、E16.5和E18.5三个发育阶段的胚胎，基因型鉴定后，E18.5胚胎进行Micro-CT骨骼扫描及三维重建分析、全骨架染色、增殖和凋亡检测。E16.5和E18.5胚胎下肢分别进行阿尔新蓝/橙黄G染色，HE染色和免疫组织化学染色，E14.5四肢进行全基因组芯片分析。②在体外实验中，分离E12.5胚胎小鼠肢芽干细胞，进行微团培养，利用阿尔新蓝染色观察软骨生成，RT-PCR检测Zeb1对软骨细胞外基质相关基因表达的影响;其次，利用Cre慢病毒介导Zeb1在Zeb1(stop)fx小鼠的原代骨髓间充质干细胞中过表达，并在小鼠间充质干细胞株C3H10T1/2中过表达Zeb1，收集细胞进行RT-PCR，观察过表达Zeb1对细胞外基质表达的影响;最后，293T细胞中转染TGFβ信号通路报告基因4×SBE和Sox9启动子，检测Zeb1对TGFβ/Smad信号通路及Sox9转录活性的调节作用。　　2.选用温肾阳方及方中两位温肾阳药淫羊藿和骨碎补进行行观察，①利用斑马鱼胚胎，分别用生理盐水、温肾阳方、骨碎补、淫羊藿中药煎剂加入胚胎培养液中于培养斑马鱼胚胎，分别在5d、7d收集胚胎，进行骨架染色。②分离E12.5天小鼠肢芽干细胞，进行微团培养，分别用生理盐水、温肾阳方、骨碎补、淫羊藿含药血清进行干预，CCK-8检测细胞增殖活性，阿尔新蓝染色观察软骨生成，RT-PCR检测TGFβ信号通路及细胞外基质的表达;293T细胞转染4×SBE及Sox9启动子，检测荧光素酶活性;E12.5肢芽干细胞中加入SB431542抑制TGFβ信号通路，阿尔新蓝染色观察软骨生成，RT-PCR检测TGFβ信号通路、细胞外基质及Zeb1mRNA的表达。　　结果:　　1.①骨架染色显示E18.5时，与同窝Cre阴性对照组比较，Zeb1Prx1胚胎四肢严重缩短，骨骼元件发育畸形，Micro-CT三维重建显示Zeb1prx1胚胎胫骨软骨内成骨障碍，组织形态学染色显示生长板阿尔新蓝染色着色较淡且不均一，增殖区细胞排列紊乱，呈簇团样生长，甚至部分软骨细胞缺失，软骨内成骨受到抑制;E18.5，PCNA染色显示Zeb1prx1胚胎生长板的软骨细胞增殖下降;TUNEL染色显示Zeb1prx1小鼠生长板凋亡增加。E16.5和E18.5免疫组织化学染色发现Zeb1Prx1生长板中细胞外基质Col2a1、Col10a1、Col1a1表达降低。②微团培养E12.5肢芽干细胞，阿尔新蓝染色显示Zeb1prx1软骨结节形成显著减少，RT-PCR显示Sox9mRNA及软骨细胞外基质Col2a1、Aggrecan mRNA显著下降。体外Zeb1质粒转染C3H10T1/2间充质细胞株和Cre慢病毒感染Zeb1小鼠间充质干细胞均导致Col2a1、Col1a1、Col10a1 mRNA表达下降。此外，Zeb1显著抑制4XSBE报告基因及Sox9启动子的活性，对Sox9启动子的抑制作用呈浓度依赖性增加。　　2.①与阴性对照组比，温肾阳方及骨碎补、淫羊藿中药在5d和7d时均能促进斑马鱼胚胎头部角腮软骨生成。②在小鼠肢芽干细胞中，温肾阳方及骨碎补、淫羊藿含药血清促进肢芽干细胞的增殖及成软骨分化，其中温肾阳方及骨碎补含药血清促进软骨细胞外基质Col2a1、Aggrecan mRNA的表达，温肾阳方及淫羊藿、骨碎补含药血清促进4×SBE报告基因活性，但是对小鼠Sox9启动子的活性无显著影响。当用SB431542抑制TGFβ信号通路后，阿尔新蓝染色显示，与阴性对照组比，温肾阳方及淫羊藿、骨碎补含药血清亦能促进软骨生成，RT-PCR显示温肾阳方及骨碎补含药血清均能促进TGFβ1 mRNA表达，并抑制Zeb1 mRNA表达，但对Zeb1的抑制作用不依赖于TGFβ信号通路。　　结论:　　1.肢芽间充质干细胞中过表达Zeb1，降低生长板软骨细胞的增殖，增加其凋亡，抑制细胞外基质的表达和软骨生成，导致软骨内成骨障碍，其机制可能与抑制TGFβ信号通路和Sox9转录相关　　2.温肾阳方及骨碎补、淫羊藿含药血清均能促进软骨生成，抑制Zeb1表达，促进TGFβ1信号通路，但是对Zeb1的抑制作用并非通过TGFβ1信号通路，具体机制还有待进一步研究。