山羊产业是我国畜牧业的重要组成部分,随着人们生活水平的提高,人们对羊肉的需求量不断增加。因此,为了提高山羊的个体产肉量,研究探索山羊肌肉生长发育的调控机理成为了热点。而miRNA,作为一类广泛存在于真核生物中的具有调控作用的非编码小分子RNA,已有大量研究表明其可通过表达量的改变影响靶基因的转录水平或蛋白表达量,而且miRNA还被证实还参与多种细胞的增殖、分化及凋亡等过程,且有研究表明相关候选miRNA通过作用于骨骼肌卫星细胞来调控动物肌肉的生长发育。本研究基于已公布的简州大耳羊胎儿不同发育阶段背最长肌组织的全基因组miRNA差异表达研究结果,选择差异显著的候选小RNA miR-206(P<0.01)作为研究对象,以大足黑山羊骨骼肌卫星细胞(SMSC)为研究材料,通过过表达体系构建,研究miR-206对体外培养SMSC增殖与分化的调控作用,并进一步筛选和验证该miRNA可能作用的靶基因及其互作关系,为山羊肌肉生长发育的分子遗传机制研究提供基础数据。本研究的主要内容及其结果如下:1.miR-206在大足黑山羊不同组织间的表达谱和原位杂交定位研究。利用荧光定量PCR分别检测胎儿期75d、出生后1d、3月龄和18月龄的大足黑山羊的miR-206表达量,结果显示miR-206在背最长肌、胸大肌、腿大肌和臀大肌中有明显的表达量,而在其他组织中几乎没有表达,且表达量的高低与肌肉发育程度相关,证实了miR-206只特异性表达在骨骼肌组织中。荧光原位杂交定位分析结果表明,miR-206大量表达在山羊SMSC的细胞核中,少量表达在细胞质中。2.miR-206对山羊SMSC增殖分化的调控作用研究。首先检测Pax7和MyoD的表达量,结果在验证Pax7和MyoD是SMSC增殖的标志基因的同时,说明本研究成功建立了山羊SMSC体外培养体系。其次,利用miR-206的过表达和抑制研究方法发现,miR-206对山羊SMSC的增殖没有产生显著影响。再次,采用成肌诱导体系Ⅳ进行细胞的分化,检测分化1d、2d、3d、4d的MyoG和MyHC的表达,结果证明MyoG和MyHC也可作为山羊SMSC分化的标志基因。进一步研究发现,过表达miR-206促进了山羊SMSC的分化,抑制miR-206表达会降低山羊SMSC的分化程度。3.miR-206对山羊SMSC分化调控机制的初步研究。利用TargetScan软件进行miR-206的靶基因预测,通过比对分析,选择HDAC4作为miR-206的靶基因并进行验证。将miR-206过表达和抑制剂分别转染到山羊SMSC中,并结合Real time-PCR及Western blotting技术检测HDAC4的不同层面表达情况。结果显示,过表达miR-206能够在转录和蛋白水平显著抑制HDAC4的表达量(P<0.05),而抑制miR-206的表达则能显著增加HDAC4的蛋白表达量。由此,验证了HDAC4基因是山羊miR-206的靶基因。同时,提取过表达miR-206组和对照组细胞的RNA,通过高通量测序筛选得到了11个差异表达的基因,分别是ANKRD1、TIMP3、CTHRC1、TGFB3、ELN、C1QTNF3、LIPG、PTBP2、FZD4、新基因LOC102184087和LOC102176691,为进一步研究miR-206调控山羊肌肉发育的的分子遗传机制提供了参考数据。总之,本研究结果初步表明,在山羊骨骼肌组织中特异性表达的miR-206,可能通过HDAC4等靶基因来调控卫星细胞的分化,从而影响山羊骨骼肌的生长发育。