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砷是一种广泛存在于自然环境中的类金属元素,也是一种公认的环境毒物。饮水砷暴露已成为全世界共同关注的重要公共卫生问题。长期慢性暴露于砷与神经发育性疾病等多种疾病的发生发展密切相关。自闭症谱系障碍（Autism spectrum disorder,ASD）是一种弥漫性中枢神经系统发育障碍性疾病。其主要临床特征包括语言和社交障碍,兴趣受限,重复刻板样行为,常伴有焦虑、学习记忆障碍及注意力缺陷等症状。ASD已经成为儿童精神类致残的最主要疾病之一,且发病率呈逐年上升的趋势。但到目前为止,ASD仍然没有明确的致病原因,也没有有效的治疗手段,因此将持续给家庭和社会带来沉重的负担。深入研究与ASD密切相关的风险因素,尤其是环境危害因素在ASD发生发展过程中的作用,进而从风险因素源头采取积极的病因预防措施,对于ASD防治具有极其重要的意义。ASD的发生发展可能与环境及遗传因素有关,而越来越多的证据表明砷是ASD的环境危险因素之一。然而相关的研究多局限于流行病学调查,关于孕哺期饮水砷暴露与自闭样行为改变的实验研究还相当缺乏,对其致病机制的研究也还非常有限。因此,本研究拟建立孕哺期饮水砷暴露小鼠模型,观察子代小鼠中的自闭样行为,为上述科学假设提供动物研究证据支持,并在此基础上进一步研究自闭样行为改变的可能分子机制。目的:建立孕哺期饮水砷暴露小鼠模型,探索孕哺期饮水砷暴露是否造成雄性仔鼠自闭样行为改变。并观察轴突数量和形态的改变,阐明孕哺期饮水砷暴露是否影响雄性仔鼠海马神经元轴突生长发育。同时,分析与轴突生长发育密切相关的AKT/GSK-3β/Kinesin-1信号通路蛋白表达改变,探究造成自闭样行为改变的相关分子机制。研究方法:1.孕哺期饮水砷暴露动物模型的建立:妊娠第0天（gestational day 0,GD 0）至仔鼠出生后28天（Postnatal Day 28,PND 28）对母鼠进行饮水砷暴露（0、0.5、5、20、50 ppm）。ASD在男性中患病率远高于女性。因此,在仔鼠出生后鉴定性别,挑选雄性仔鼠进入研究。2.仔鼠尿砷浓度和脑内砷浓度检测:于PND 28和PND 56收集仔鼠12小时尿液和脑组织（皮质、海马、小脑）。用原子吸收分光光度计测定尿中砷的含量（i As、MMA、DMA、TMA、t As）,测定皮质,海马,小脑三个脑区的砷含量（t As）。3.观察孕哺期饮水砷暴露对仔鼠自闭样行为的影响:采用超声交流测试和三箱社交实验观察母体饮水砷暴露是否造成仔鼠社交能力和新事物认知能力缺陷;采用自我修饰行为测试、埋珠实验和T迷宫自发性选择实验观察母体饮水砷暴露是否造成仔鼠重复限制样行为改变;采用旷场实验观察母体饮水砷暴露是否造成仔鼠焦虑样行为改变;采用莫里斯水迷宫测试观察母体饮水砷暴露是否造成仔鼠学习认知能力下降。4.观察孕哺期饮水砷暴露对仔鼠海马神经元轴突发育的影响:使用神经丝轻链蛋白（Neurofilament light chain,NFL）免疫荧光染色观察海马神经元轴突损伤。使用Western blot法检测NFL蛋白表达水平。5.AKT/GSK-3β/Kinesin-1信号通路的检测:Western blot法检测PND 28、PND56仔鼠海马AKT、p-AKT Ser 473、GSK-3β、p-GSK-3βSer 9、KHC、KLC1蛋白表达水平。结果:1.孕哺期饮水砷暴露对仔鼠体重和脑重的影响。对仔鼠体重的监测结果表明,在实验期间,对照组与砷暴露组仔鼠体重无明显差异（P﹥0.05）。对照组与砷暴露组仔鼠皮质、海马和小脑重量均无明显差异（P﹥0.05）。2.孕哺期饮水砷暴露导致仔鼠尿砷浓度和脑组织砷浓度增高。PND 28时,高剂量砷暴露组（5 ppm、20 ppm、50 ppm砷暴露组）仔鼠尿液中t As、i As、MMA、DMA浓度较对照组明显升高（P<0.05）。PND 56时砷暴露组仔鼠尿中t As、i As、MMA、DMA浓度较PND 28时出现明显下降,砷暴露组与对照组之间无明显差异。PND 28时,高剂量砷暴露组仔鼠的皮质、海马和小脑中t As、浓度较对照组明显升高（P<0.05）。PND 56时砷暴露组仔鼠皮质、海马和小脑中t As浓度较PND 28时出现明显下降,砷暴露组与对照组之间无明显差异。3.孕哺期饮水砷暴露导致仔鼠的社交能力异常。超声交流测试结果表明高剂量砷暴露组仔鼠超声发声次数和总时长显著下降,20 ppm、50 ppm组仔鼠发声潜伏显著延长（P<0.05）,提示高剂量砷暴露降低了幼鼠交流能力。三箱社交实验结果显示高剂量砷暴露组仔鼠的社交总时长明显低于对照组（P<0.05）;在三箱社交实验第三阶段的测试中,对照组仔鼠在含有陌生鼠1（S1）的箱体内（R1）停留的时间明显高于高剂量砷暴露组仔鼠（P<0.05）,表明高剂量砷暴露组仔鼠出现了社交行为缺陷。4.孕哺期饮水砷暴露导致仔鼠社会新奇偏好行为异常。三箱社交实验结果显示,在第三阶段的测试中砷暴露组仔鼠在有S1的R1中逗留时间和放置空笼子的R2中的逗留时间无明显差异。在第四阶段测试中,高剂量砷暴露组仔鼠在放置S1的R1和在放入陌生鼠2（S2）的R2中逗留的时间无明显差异,且20 ppm和50 ppm组仔鼠与S2交流的时间同与S1交流的时间相比并无明显差异,提示高剂量砷暴露会导致仔鼠的社会新奇偏好行为异常。5.孕哺期饮水砷暴露导致仔鼠重复刻板行为。自我修饰行为测试结果显示高剂量砷暴露组的仔鼠自我修饰时间增加（P<0.05）;埋珠实验结果显示砷暴露组仔鼠埋珠数量高于对照组;T迷宫自发性选择实验结果显示高剂量砷暴露组仔鼠正确交替选择数和选择率明显下降（P<0.05）。上述实验表明高剂量砷暴露组仔鼠重复刻板样行为明显增多。6.孕哺期饮水砷暴露导致仔鼠焦虑样行为。旷场实验评估仔鼠的焦虑样行为,结果显示高剂量砷暴露组的仔鼠进入中心区域的次数以及在中心区域停留时间比对照组少（P<0.05）。7.孕哺期饮水砷暴露导致仔鼠学习认知行为异常。莫里斯水迷宫实验评估仔鼠的学习记忆能力,结果显示高剂量砷暴露组的仔鼠到达平台次数和在平台所在象限逗留的时间明显减少（P<0.05）,且高剂量砷暴露组的仔鼠第一次抵达平台的潜伏期较对照组更长（P<0.05）。8.孕哺期饮水砷暴露导致仔鼠海马神经元轴突发育障碍。免疫荧光结果表明,PND 28的砷暴露组仔鼠海马CA1区、CA3区及DG区神经元轴突长度和密度较对照组仔鼠减少,且PND 56砷暴露组仔鼠轴突长度和密度并未恢复至正常水平。Western blot检测结果显示,PND 28和PND 56的5 ppm组和20 ppm组仔鼠海马组织NFL表达水平较对照组仔鼠明显下降（P<0.05）。9.孕哺期饮水砷暴露激活仔鼠海马AKT/GSK-3β/Kinesin-1信号通路。PND 28和PND 56的5 ppm组和20 ppm组仔鼠海马p-AKT Ser 473、p-GSK-3βSer 9、KHC、KLC1表达水平较对照组仔鼠明显下降（P<0.05）。与对照组相比,砷暴露组仔鼠海马AKT、GSK-3β表达无明显变化（P﹥0.05）。结论:1.孕哺期饮水砷暴露会导致雄性子代出现自闭样行为。2.孕哺期饮水砷暴露会干扰雄性子代海马中的AKT/GSK-3β/Kinesin-1信号通路,损伤子代海马的轴突发育,而这种损伤可能是自闭样行为的机制之一。