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第一部分TGF-β1/miRNA/靶基因轴生物信息学研究TGF-β1可促进皮肤鳞癌的发病与恶化。研究表明,TGF-β1在多种癌细胞中可使miR-27a、miR-29b-1、miR-143/145、miR-149、miR-181b、miR-194、miR-196a、miR-497 的水平升高。为了揭示 TGF-β1 是否通过激活 miR-27a、miR-29b-1、miR-143/145、miR-149、miR-181b、miR-194、miR-196a、miR-497的表达,进而调控其靶基因,促进皮肤鳞癌的发病与恶化,首先进行生物信息学研究,以确定目标TGF-β1/miRNA/耙基因轴。由于miRNA名称在不同数据库中有所不同,首先明确了不同数据库中同一 miRNA不同名称的对应关系,然后分别在TargetScan、DIANAMicroT和miRDB数据库分别找出了 miR-27a、miR-29b-1、miR-143/145、miR-149、miR-181b、miR-194、miR-196a、miR-497 中每一个 miRNA的全部靶基因,分别取其中排列在前100位的靶基因,在这3个数据结果中均出现的基因一共有99个,除hsa-miR-181b-5p没有获得靶基因的数据外,获得miR-143靶基因18个、miR-145 靶基因8个、miR-149靶基因1]个、miR-194靶基因13个、miR-196a靶基因22个、miR-27a靶基因13个、miR-29b-1靶基因13个、miR-497靶基因1个。利用DAVID数据库对交集靶基因的Gene Ontology 的 Cellular Component、Molecular Function、Biological Process 进行分析,然后利用 GO、Uniprot、TSGene数据库,对交集的靶基因进行功能分类,找出了与肿瘤相关的靶基因。通过Targetscan搜索目标miRNA与目标基因的碱基配对程度,选择miR-27a-3p进行后续的研究。文献报道miR-27a-3p对应靶基因FBXW7在多种鳞癌、上皮细胞癌癌中具有作用。因此,最后选定TGF-β1/miR-27a-3p/FBXW7轴来研究其对皮肤鳞癌细胞的生物学效应。第二部分TGF-β1/miR-27a-3p/FBXW7轴的验证与鉴定为了验证并鉴定人皮肤鳞癌A431细胞中TGF-β1/miR-27a-3p/FBXW7轴的存在,首先验证TGF-β1对A431细胞增殖的作用并进一步检测受TGF-β1调控的siRNA。采用TGF-β1 siRNA及其阴性对照control-siRNA转染A431细胞,观察细胞的生长情况。结果显示,与对照组相比,TGF-β1 siRNA使得A431细胞生长减慢,与文献报道一致。采用实时定量荧光PCR检测TGF-β1 siRNA转染的A431细胞内目标miRNA的水平。首先对PCR仪器等检测系统进行了校验,标准曲线的相关系数提示,系统符合检测标准。QPCR检测目标miRNA的溶解曲线显示只有一个峰,说明所设计的引物是特异性的,PCR扩增反应也是特异性的反应。QPCR检测结果显示,TGF-β1 siRNA转染的A431细胞内目标miRNA hsa-miR-27a、hsa-miR-29b-1、hsa-miR-143、hsa-miR-145、hsa-miR-149、hsa-miR-181 b、hsa-miR-194、hsa-miR-196a、hsa-miR-497的拷贝数要低于对照组的拷贝数,说明TGF-β1在人皮肤鳞癌A431细胞内对hsa-miR-27a、hsa-miR-29b-1、hsa-miR-143、hsa-miR-145、hsa-miR-149、hsa-miR-181 b、hsa-miR-194、hsa-miR-196a、hsa-miR-497具有同向调控作用。构建了 FBXW7基因3’UTR序列pMIR-Glo-WP-正常、pMIR-Glo-WP-突变质粒,采用测序确认其正确性,在此基础上进一步采用双荧光素酶报告系统检测miR-27a-3p与靶基因FBXW7的关系相互作用。分别将FBXW7基因3’UTR的正常组质粒与内参载体及miR-NC/27a-3p,突变组质粒与内参载体及miR-NC/27a-3p共转染后,采用多功能酶标仪测定萤火虫荧光素和海肾荧光素表达量。统计分析结果显示,miR-27a-3p可以调控FBXW7基因3’UTR的luciferase的表达(p<0.01)。在结合位点突变后,这种调控关系消失,由此可知miR-27a-3p可通过该结合位点调控luciferase的表达。miR-27a-3pmimic能够特异性结合到FBXW7基因3’UTR区种子序列,抑制荧光素酶的表达,这一结果与miRBase、Targetscan数据库预期结果一致。因此,人皮肤鳞癌A431细胞中TGF-β1/miR-27a-3p/FBXW7轴的存在得到验证并鉴定。第三部分TGF-β1/miR-27a-3p/FBXW7轴在皮肤鳞癌细胞增殖、细胞周期、侵袭中的作用为了研究TGF-β1/miR-27a-3p/FBXW7轴在皮肤鳞癌细胞增殖、细胞周期、侵袭中的作用,首先构建了 pcDNA3.1-FBXW7过表达与SD1211-si-FBXW7干扰重组载体。在此基础上,进一步研究miR-27a-3p与FBXW7表达对人皮肤鳞癌A431细胞增殖中的影响。将miR-27a-3pmimic、miR-27a-3pinhibitor、FBXW7基因过表达质粒、干扰质粒转染人皮肤鳞癌A431细胞,在显微镜下可以观察到miR-27a-3pmimic转染的A431细胞要比miR-27a-3p inhibitor转染的A431细胞增殖快,而FBXW7基因过表达质粒转染的A431细胞要比FBXW7基因干扰质粒转染的A431细胞增殖慢。进一步采用CCK-8检测miR-27a-3p和FBXW7基因过表达、干扰对细胞增殖的影响,结果显示,与正常A431细胞对照组相比,miR-27a-3p-mimic转染组A431细胞增殖增加,miR-27a-3p-inhibitor转染组A431细胞增殖降低,FBXW7过表达组A431细胞增殖降低,而FBXW7干扰组A431细胞增殖增加,而且随时间的延长,作用更加明显,结果表明,miR-27a-3p对A431细胞增殖有促进作用,而FBXW7对A431细胞增殖有抑制作用。为了研究miR-27a-3p与FBXW7表达对人皮肤鳞癌A431细胞周期中的影响,将miR-27a-3pmimic、miR-27a-3p inhibitor、FBXW7基因过表达质粒、干扰质粒转染人皮肤鳞癌A431细胞,采用流式细胞术检测miR-27a-3p和FBXW7基因过表达干扰对细胞周期改变的影响。结果显示,与正常A431细胞对照组相比,miR-27a-3p-mimic转染组A431细胞G1期细胞比例下降、G2期的比例不变,S期细胞比例增加,miR-27a-3p-inhibitor转染组A431细胞G1期细胞比例下降,G2期的比例大大增加,S期细胞比例下降,FBXW7过表达组A431细胞G1期细胞比例不变,G2期的比例大大增加,S期细胞比例下降,而FBXW7干扰组A431细胞G1期细胞比例下降、G2期的比例不变,S期细胞比例增加,结果表明,miR-27a-3p促进A431细胞从G1期进入S期细胞,阻滞于S/G2期;FBXW7促进A431细胞从S期进入G2期,阻滞于M/G2期。为了研究miR-27a-3p与FBXW7表达对人皮肤鳞癌A431细胞侵袭能力的影响,采用Transwell侵袭实验检测miR-27a-3p和FBXW7基因过表达干扰对细胞侵袭能力的影响。结果显示,与正常A431细胞对照组相比,miR-27a-3p-mimic转染组A431细胞侵袭能力提高,miR-27a-3p-inhibitor转染组A431细胞侵袭能力降低,FBXW7过表达组A431细胞侵袭能力降低,而FBXW7干扰组A431细胞侵袭能力提高。结果表明,miR-27a-3p对A431细胞侵袭能力有促进作用,而FBXW7对A431细胞侵袭能力有抑制作用。