ARF是一个重要的肿瘤抑制蛋白，编码ARF的INK4a/ARF基因位点位于人类染色体9p21区域。INK4a/ARF基因位点的缺失是人类肿瘤发生过程中最经常发生的事件之一，其在大约40％的人类肿瘤中发生了缺失和突变，包括恶性黑色素瘤、胰腺癌、神经胶质瘤、某些类型的白血病、非小细胞肺癌、乳腺癌和膀胱癌。而在结肠癌中，在表观遗传水平上ARF基因的转录调控区则发生了甲基化修饰被沉默。因此，ARF的失活和突变在肿瘤的发生中具有重要作用。　　 ARF被广泛认为的最重要的一个功能是参与癌基因诱导的Mdm2/p53依赖性细胞周期检验点的调控。在癌基因活化时，ARF通过激活p53而抑制癌基因造成的细胞过度增殖。在正常情况下，ARF的表达量非常低;但当细胞中癌基因活化时，ARF就被诱导表达。Mdm2是p53的主要负调控蛋白，ARF通过抑制Mdm2(在人类中为Hdm2)的功能，引起p53依赖的细胞周期阻滞和细胞凋亡。ARF与Mdm2直接结合，从而阻碍Mdm2介导的p53泛素化、核输出、以及随后的降解。同时，ARF也被认为可以通过将Mdm2束缚在核仁中而稳定核浆中的p53。另外，ARF也可以通过抑制最近发现的E3泛素化连接酶ARF-BPl/Mule对p53的泛素化降解，而稳定p53。除此之外，ARF还通过p53非依赖性途径发挥肿瘤抑制功能，如ARF可以与E2F1，c-Myc，NPM/B23，Tip60等蛋白相互作用并调节不同的信号通路。　　 除了参与癌基因活化的感应，研究发现ARF还参与另外一个重要的细胞检控点---DNA损伤检控点（DNAdamagecheckpoint）的调控。　　 但在ARF功能与调控的研究方面仍有许多问题不清楚。其中一个重要的没有解决的问题是:ARF如何感应癌基因活化和DNA损伤，即癌基因活化和DNA损伤诱导ARF的机制是什么。mRNA的转录可能在某些情况下调控ARF的表达;但蛋白翻译后修饰在ARF的诱导表达中也发挥关键作用。这方面的研究虽然取得了一些积极进展，但仍存在许多问题。为了深入研究ARF的功能和调控，本论文工作利用酵母双杂交筛选发现了一个新的ARF结合蛋白NMI，并对NMI调控ARF的功能进行了研究。　　 首先，本论文工作在293T细胞过表达实验中验证了NMI与ARF的结合。接着利用GST-pulldown体外实验进一步证实了NMI与ARF存在直接结合。为了研究NMI对ARF的调控，我们构建了H1299-NMI细胞系。有趣的是，在H1299-NMI细胞系中，发现ARF的表达水平显著升高。实时定量RT-PCR实验揭示ARFmRNA水平并没有发生变化，因此暗示NMI可能调控ARF蛋白的稳定性。接下来，在p53缺失的H1299非小细胞肺癌细胞和p53野生的人骨肉瘤U2OS细胞中，转染NMI都可以引起内源性ARF蛋白的水平上升，这同时说明了NMI对ARF的诱导是p53非依赖性的。通过测定蛋白半衰期，发现NMI的确增强了ARF蛋白的稳定性。为了深入研究NMI如何调控ARF蛋白的稳定性，本论文工作在机理方面进行了探索。我们发现NMI通过竞争性结合ARF的E3泛素化连接酶ULF，抑制ULF对ARF的泛素化修饰，增强ARF蛋白的稳定性。这些是ARF诱导表达机理研究方面的新发现。本论文工作进一步对NMI调控ARF的诱导表达进行了研究，发现癌基因（如c-Myc、E2F1）活化、DNA损伤和IFNα刺激等细胞胁迫引起NMI水平升高，并伴随ARF的诱导表达。并且，在MMS处理和IFNα刺激时，NMI能够从细胞质转运到细胞核中与ARF结合，可能通过向细胞核的转运实现对ARF诱导表达的调控作用。利用shRNA降低NMI的表达，发现MMS处理和IFNα刺激诱导的ARF表达受到了很大程度的抑制。最后，通过细胞增殖实验和流式细胞术检测细胞周期分布，本论文工作证实细胞胁迫刺激通过NMI和ARF激活了ATM/Chk2信号通路，使细胞周期阻滞于G2/M期，引起细胞增殖的抑制，这些结果说明了NMI可能在细胞胁迫时ARF的诱导表达中发挥重要作用。NMI可能在蛋白翻译后泛素化修饰方面通过ULF调控ARF的水平。利用这种机制，NMI参与了DNA损伤或癌基因活化时ARF的诱导表达，并间接地调节ARF引起的细胞周期阻滞、细胞凋亡或细胞衰老等生物学过程，在ARF行使肿瘤抑制功能过程中发挥作用。　　 总之，本论文工作发现了一个新的ARF结合蛋白NMI，并发现在细胞受到某些胁迫时，NMI参与了一个新的转录非依赖性的ARF调节过程，预示着ARF所受到的调控远比我们认识的复杂，也为后续的进一步深入研究打下了基础。