目的：探讨缺血预适应(ischemic preconditioning,1PC)改善猪急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)再灌注后心肌无再流和再灌注损伤的作用是否依赖蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)信号通路。方法：中华小型猪40只,随机分为假手术组、梗死组、IPC组(在结扎冠脉前30分钟,行3个循环的5分钟缺血／再灌注)、IPC+PKA抑制剂H-89 (IPC+H-89)组和H-89组,每组8只。开胸结扎冠状动脉90分钟,再开放180分钟,制备AMI再灌注模型。术中监测血流动力学；病理染色法测定心肌无再流面积(area of no-reflow, ANR)和心肌坏死面积(area of necrosis, AN);病理组织HE染色测定心肌组织灶性出血和中性粒细胞浸润程度、心肌细胞横切面面积(cardiomyocyte cross-sectional area, CSA)；荧光定量法测定毛细血管渗透性；水含量法测定心肌组织含水量；电镜下观察心肌微血管内皮和心肌细胞超微结构,测定线粒体横切面面积(mitochondria cross-sectional area, MSA);化学法测定血清肌酸激酶(creatine kinase, CK),心肌组织丙二醛(malondialdehyde, MDA)和一氧化氮(nitric oxide,NO)含量,测定心肌组织PKA、髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)和一氧化氮合酶(nitric-oxide synthase, NOS)活性；TUNEL染色法检测心肌细胞凋亡；免疫印迹法(Western blotting)测定心肌PKA, Thr198磷酸化(p)-PKA、内皮型NOS (eNOS)、p-eNOS (Ser1179和Ser635)、Ser133磷酸化cAMP反应元件结合蛋白(phosphorated cAMP response element-binding protein, p-CREB)、TNF-α、p-选择素、水通道蛋白(aquaporins, AQPs)、抑凋亡蛋白Bcl-2、凋亡蛋白Bax和半胱天冬酶-3(caspase-3)的表达。结果：血流动力学监测显示：在缺血和再灌注期间,梗死组血流动力学变化较缺血前明显恶化(P均<0.05),IPC降低了缺血90分钟时的心率(P<0.05),而PKA抑制剂H-89升高了缺血90分钟时的dp/dtmin(P<0.05)心肌无再流面积和梗死面积检测显示：梗死组ANR和AN分别为48.64%和78.46%,IPC将ANR和AN减小至9.71%和31.3%(P<0.01),H-89虽也显著减小了ANR(29.46%,P<0.01),但部分消除了IPC的作用。在缺血90分钟和再灌注180分钟时,梗死组CK水平较假手术组分别高2.7倍和3.45倍(P均<0.05),IPC组较梗死组分别降低了51.5%和31.9%(P<0.05),H-89消除了IPC降低缺血90分钟时CK水平的作用。提示,IPC减轻AMI再灌注后心肌无再流和心肌坏死的作用部分受PKA通路调节。心肌PKA通路活性检测显示：梗死组再流区和无再流区PKA活性较假手术组分别高1.58倍和2.02倍(P均<0.001),IPC组再流区和无再流区PKA活性较梗死组分别高1.27倍和1.28倍(P均<0.001),IPC+H-89组较IPC组分别低40.8%和32.4%(P均<0.05)。在再流区,梗死组Thr198 p-PKA和Ser133 p-CREB表达高于假手术组(P均<0.05),IPC组Ser133 p-CREB表达高于梗死组(P<0.01)；在无再流区,梗死组Ser133 p-CREB表达高于假手术组(P<0.05), IPC组PKA、Thr198 p-PKA和Ser133 p-CREB表达高于梗死组(P均<0.05),IPC+H-89组再流区和无再流区Ser133 p-CREB表达低于IPC组(P均<0.05)。结果表明,在缺血和再灌注期间PKA通路被激活,而IPC进一步激活了PKA通路的活性。心肌微血管结构和功能检测显示：IPC将再流区和无再流区心肌灶性出血评分从梗死组的1.73和1.8分别降至0.75和1.23(P均<0.01),而H-89部分消除了IPC的作用。梗死组再流区和无再流区中性粒细胞浸润明显增加,IPC明显抑制了再流区中性粒细胞浸润(P均<0.01),而H-89消除了IPC的作用。电镜下发现,梗死组缺血区微血管内皮明显损伤,局部破裂出血,内皮细胞和心肌细胞凋亡及坏死较多；IPC明显减轻微血管内皮和心肌细胞损伤,H-89部分消除了IPC的作用。梗死组再流区和无再流区血管渗透性分别较假手术组高1.83倍和1.86倍(P均<0.05),IPC组再流区和无再流区血管渗透性分别较梗死组降低了25.9%和29.6%(P均<0.05),而H-89消除了IPC的作用。梗死组再流区和无再流区iNOS活性分别较假手术组低48.7%和57.9%(P均<0.01),IPC组无再流区tNOS和cNOS活性较梗死组分别高52.7%和70.7%(P均<0.05),而H-89抑制了IPC的作用。在再流区,梗死组eNOS表达高于假手术组,IPC组eNOS表达高于梗死组(P均<0.05)；在无再流区,梗死组Ser1179 p-eNOS和Ser635 p-eNOS表达高于假手术组,IPC组表达高于梗死组,IPC+H-89组表达又低于IPC组(P均<0.05)。结果表明,IPC保护微血管内皮结构和功能的作用受PKA通路部分调节。心肌组织炎症反应检测显示：梗死组再流区和无再流区MPO活性较假手术组分别高2.5倍和1.92倍(P均<0.05),MDA含量较假手术组分别高4.74倍和4.63倍(P均<0.05)；与梗死组比较,IPC组再流区和无再流区MPO活性分别降低了86.2%和62.1%(P均<0.05),MDA含量分别降低了66.6%和46.4%(P均<0.05),而H-89消除了IPC的作用。梗死组缺血区心肌TNF-α和P-selectin表达高于假手术组(P均<0.05),IPC组再流区和无再流区TNF-a和P-selectin表达均较梗死组降低(P均<0.05),而IPC+H-89组再流区和无再流区P-selectin及无再流区TNF-α高于IPC组(P均<0.05)。心肌组织水肿检测显示：梗死组左心室、再流区和无再流区组织含水量较假手术组分别高1.43%、7.36%和5.83%(P均<0.05),IPC组左心室和再流区组织含水量较梗死组分别低0.95%和5.09%(P均<0.05),而H-89消除了IPC的作用。梗死组再流区和无再流区CSA较假手术组分别高1.96倍和2.1倍(P均<0.05),IPC组再流区CSA较梗死组低19.7%(P<0.01),IPC+H-89组再流区CSA较IPC组高12.8%(P<0.01)。梗死组再流区和无再流区MSA较假手术组分别高2.17倍和2.99倍(P均<0.001),IPC组再流区和无再流区MSA较梗死组分别低34.7%和28.5%(P均<0.05),IPC+H-89组较IPC组分别高30.8%和24.2%(P均>0.05)。在再流区,梗死组心肌AQP-1、-8和-9表达高于假手术组,而IPC组AQP-8表达低于梗死组(P均<0.01)；在无再流区,梗死组AQP-1和-9表达高于假手术组,IPC组AQP-4、-8和-9表达低于梗死组(P均<0.05),而H-89消除了IPC的作用。结果显示,IPC减轻缺血再灌注损伤后心肌水肿的作用与通过PKA通路抑制AQPs表达有关。心肌细胞凋亡检测显示：梗死组再流区和无再流区心肌细胞凋亡指数较假手术组高10.49倍和14.99倍(P均<0.001),IPC组再流区和无再流区心肌细胞凋亡指数较梗死组分别低69.7%和25.8%(P均<0.001),而IPC+H-89组心肌细胞凋亡指数较IPC组高2.89倍和1.2倍(P均<0.05)。与假手术组比较,梗死组缺血区心肌抑凋亡蛋白Bcl-2表达增高,促凋亡蛋白Bax表达降低,Bcl-2/Bax比值增高,凋亡蛋白Caspase-3表达增高(P均<0.05)；与梗死组比较,IPC组Bcl-2表达增加,Bax表达降低,Bcl-2/Bax比值增高(P均<0.05),H-89消除了IPC的作用。结论：1.在猪AMI前30分钟给予IPC预处理,可以明显改善再灌注后心肌无再流和再灌注损伤,与保护微血管内皮结构和功能、减轻炎症反应、减轻心肌水肿和细胞凋亡有关；2.IPC的心脏保护作用部分受PKA通路调节。目的：探讨他汀类药物(statins)改善猪急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)再灌注后心肌无再流和再灌注损伤的作用是否依赖蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)信号通路。方法：中华小型猪40只,随机分为假手术组、梗死组、辛伐他汀(simvastatin, SIM; 2mg-kg-1,结扎冠脉前1小时给药)组、SIM+PKA抑制剂H-89 (SIM+H-89)组和H-89组,每组8只。开胸结扎冠状动脉90分钟,再开放180分钟,制备AMI再灌注模型。术中及术后检测方法同摘要(一)结果：血流动力学监测显示：在缺血和再灌注期间,梗死组血流动力学变化较缺血前明显恶化(P<0.05)；SIM组血流动力学各指标在再灌注180分钟时较梗死组有改善,然均无显著差异(P均>0.05)；SIM+H-89组缺血90分钟时的心率和dp/dtmax较SIM组降低(P均<0.05)。心肌无再流面积和梗死面积检测显示：梗死组ANR和AN分别为48.64%和78.46%,SIM将ANR和AN减小至36.1%和64.1%(P均<0.01),然SIM+H-89组AN较SIM组高1.2倍(P<0.01)。SIM组CK水平在缺血90分钟和再灌注180分钟时分别较梗死组降低了40.9%和26.9%(P均<0.05),然SIM+H-89组CK水平在再灌注180分钟时较SIM组高1.3倍(P<0.01)。提示,SIM减轻AMI再灌注后心肌无再流和心肌坏死的作用部分受PKA通路调节。心肌PKA通路活性检测显示：梗死组再流区和无再流区PKA活性较假手术组分别高1.58倍和2.02倍(P均<0.001),SIM组再流区和无再流区PKA活性较梗死组分别高1.28倍和1.19倍(P均<0.001),SIM+H-89组较SIM组分别低23.1%和20.5%(P均<0.05)。在再流区,梗死组Thr198 p-PKA和Serl33 p-CREB表达高于假手术组(P均<0.05),SIM组再流区Ser133 p-CREB表达高于梗死组(P<0.01)；在无再流区,梗死组Ser133 p-CREB表达高于假手术组(P<0.05),SIM组PKA、Thr198 p-PKA和Ser133 p-CREB表达高于梗死组(P均<0.05)；SIM+H-89组再流区和无再流区PKA及Ser133 p-CREB表达均较SIM组降低(P均<0.01)。结果表明,在缺血和再灌注期间PKA通路被激活,而SIM进一步激活了PKA通路的活性。心肌微血管结构和功能检测显示：SIM将再流区和无再流区心肌灶性出血评分从梗死组的1.73和1.8均降至1.18(P均<0.01),而H-89部分消除了SIM的作用。梗死组再流区和无再流区中性粒细胞浸润明显增加,SIM明显抑制了再流区中性粒细胞浸润,而H-89消除了SIM的作用(P均<0.01)。电镜下发现,SIM明显减轻微血管内皮和心肌细胞损伤,而H-89部分消除了SIM的作用。梗死组再流区和无再流区血管渗透性分别较假手术组高1.83倍和1.86倍(P均<0.05),SIM组再流区血管渗透性较梗死组降低了25.97%(P<0.05),而SIM+H-89组再流区血管渗透性较SIM组高1.29倍(P<0.05)。SIM组再流区和无再流区cNOS活性较梗死组分别高67.5%(P<0.05)和46.3%(P>0.05),而H-89抑制了SIM的作用。在再流区,SIM组Ser1179p-eNOS和Ser635 p-eNOS表达高于梗死组(P均<0.05),然SIM+H-89组Ser635 p-eNOS表达低于SIM组(P<0.05)；在无再流区,SIM组Ser635 p-eNOS表达高于梗死组(P<0.05)。结果说明,SIM改善微血管内皮结构和功能的作用受PKA通路部分调节。心肌组织炎症反应检测显示：梗死组再流区和无再流区MPO活性较假手术组分别高2.5倍和1.92倍(P均<0.05),MDA含量较假手术组分别高4.74倍和4.63倍(P均<0.05)；与梗死组比较,SIM组再流区和无再流区MPO活性分别降低了74.2%和59.8%(P均<0.05),MDA含量分别降低了46.7%和53.8%(P均<0.05),而H-89消除了SIM的作用。梗死组缺血区心肌TNF-α和P-selectin表达高于假手术组(P均<0.05),SIM组非缺血区和无再流区心肌TNF-α及P-selectin表达显著降低(P均<0.05),而SIM+H-89组再流区和无再流区P-selectin表达较SIM组增高(P均<0.05)。心肌组织水肿检测显示：梗死组左心室、再流区和无再流区组织含水量较假手术组分别高1.43%、7.36%和5.83%(P均<0.05),SIM组再流区组织含水量较梗死组低5.6%(P<0.05),而H-89消除了SIM的作用。梗死组再流区和无再流区CSA较假手术组分别高1.96倍和2.1倍(P均<0.01),SIM组再流区CSA较梗死组低20.03%(P<0.01),SIM+H-89组再流区CSA又较SIM组高1.13倍(P<0.01)。梗死组再流区和无再流区MSA较假手术组分别高2.17倍和2.99倍(P均<0.001)SIM组再流区和无再流区MSA较梗死组分别低39.1%和33.0%(P均<0.05),而H-89部分消除了SIM的作用。在再流区,梗死组心肌AQP-1、-8和-9蛋白表达高于假手术组(P均<0.01),SIM组AQP-8和-9表达低于梗死组(P均<0.01),而SIM+H-89组AQP-8和AQP-9表达高于SIM组(P均<0.05)；在无再流区,梗死组AQP-1和-9表达高于假手术组,SIM组AQP-1、-4、-8和-9表达低于梗死组(P均<0.05),而SIM+H-89组AQP-4表达较SIM组增高(P<0.01)。结果显示,SIM减轻缺血再灌注损伤后心肌水肿的作用与通过PKA通路抑制AQPs的表达有关。心肌细胞凋亡检测显示：梗死组再流区和无再流区心肌细胞凋亡指数较假手术组高10.49倍和14.99倍(P均<0.001),SIM组再流区和无再流区心肌细胞凋亡指数分别较梗死组降低了57.9%和27.4%(P均<0.001),然SIM+H-89组再流区和无再流区心肌细胞凋亡指数较SIM组分别高1.76倍和1.24倍(P均<0.01)。与假手术组比较,梗死组缺血区心肌抑凋亡蛋白Bcl-2表达增高,促凋亡蛋白Bax表达降低,Bcl-2/Bax比值增高,凋亡蛋白Caspase-3表达增高(P均<0.05)；与梗死组比较,SIM组Bcl-2表达增加,Bax表达降低,Bcl-2/Bax比值增高(P均<0.05),而H-89消除了SIM的作用。结论：1.在猪AMI前1小时给予单次负荷剂量SIM预处理,可以明显改善再灌注后心肌无再流和再灌注损伤,与保护微血管内皮结构和功能、减轻炎症反应、减轻心肌水肿和细胞凋亡有关；2.SIM的心脏保护作用部分受PKA通路调节。目的：探讨中药通心络(tongxinluo, TXL)改善猪急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)再灌注后心肌无再流和再灌注损伤的作用是否依赖蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)信号通路。对IPC、SIM和TXL的作用进行比较,试图揭示三者改善AMI再灌注后心肌无再流和再灌注损伤作用和机制的异同。方法：中华小型猪40只,随机分为假手术组、梗死组、TXL (0.05 g-kg-1,结扎冠脉前1小时给药)组、TXL+H-89组和H-89组,每组8只。进一步比较IPC、SIM和TXL三者作用的异同。术中及术后检测方法同摘要(一)结果：血流动力学监测显示：在缺血和再灌注期间,梗死组血流动力学变化较缺血前明显恶化(P均<0.05),TXL降低了缺血90分钟时的心率(P<0.05),IPC、SIM和TXL三者对血流动力学各指标的影响无显著差异(P均>0.05)心肌无再流面积和梗死面积检测显示：梗死组ANR和AN分别为48.64%和78.46%(P均<0.01),TXL将ANR和AN减小至9.7%和59.2%(P均<0.01),然TXL+H-89组心肌无再流面积和梗死面积较TXL组分别高3.0倍和1.3倍(P均<0.05)。TXL减小无再流面积的作用优于SIM(36.07%,P<0.01),不次于IPC(9.71%,P>0.05)；TXL减小心肌梗死面积的作用稍弱于IPC(31.3%,P<0.01)与SIM无显著差异(64.14%,P>0.05)。在缺血90分钟和再灌注180分钟时,TXL组CK水平分别较梗死组降低了35.6%和25.1%(P均<0.05),H-89消除了TXL降低缺血90分钟时CK水平的作用。结果表明,TXL减轻AMI再灌注后心肌无再流和心肌坏死的作用部分受PKA通路调节；IPC、SIM和TXL三者中,IPC的心脏保护作用最好,TXL次之,SIM最差。心肌PKA通路活性检测显示：TXL组再流区PKA活性较梗死组高1.26倍(P<0.05),而TXL+H-89组再流区PKA活性较TXL组低21.9%(P<0.05)。TXL组再流区Ser133 p-CREB表达高于梗死组(P<0.01),无再流区PKA、Thr198p-PKA和Ser133 p-CREB表达高于梗死组(P均<0.05),且TXL组无再流区Ser133 p-CREB表达高于IPC组和SIM组(P均<0.05),然TXL+H-89组再流区PKA和Ser133 p-CREB及无再流区Ser133 p-CREB表达较TXL组降低(P均<0.05)。结果表明,TXL激活了PKA通路活性,且作用强于IPC和SIM。心肌微血管结构和功能检测显示：TXL组缺血区灶性出血率与梗死组无显著差异(P>0.05),而高于IPC组和SIM组(P均<0.05)。电镜下发现,TXL明显减轻了微血管内皮和心肌细胞损伤,作用与IPC和SIM相似,而H-89部分消除了TXL的作用。TXL组再流区和无再流区血管渗透性较梗死组分别降低了37.8%和32.8%(P均<0.05),作用与IPC相当,但稍强于SIM,而H-89完全消除了TXL的作用。TXL组无再流区tNOS和cNOS活性较梗死组分别增高59.5%和65.9%(P均<0.05),且作用不次于IPC和SIM,而H-89抑制了TXL的作用。TXL组无再流区Ser635p-eNOS表达高于梗死组、IPC组和SIM组(P均<0.05),然TXL+H-89组Ser635p-eNOS表达低于TXL组(P<0.05),提示TXL调节Ser635 p-eNOS表达的作用稍强于IPC和SIM。结果表明,TXL改善微血管内皮结构和功能的作用受PKA通路部分调节,且作用不次于IPC和TXL。心肌组织炎症反应检测显示：TXL组再流区和无再流区MPO活性较梗死组分别降低了63.5%和30.5%(P均<0.05),MDA含量较梗死组分别降低了66.1%和59.6%(P均<0.05),且TXL的作用与IPC和SIM无明显差异.(P均>0.05),而H-89消除了TXL的作用。TXL明显降低了无再流区TNF-a和P-selectin的表达(P均<0.05),但TXL抑制无再流区P-selectin的作用弱于IPC和SIM(P均<0.05),而TXL+H-89组缺血区TNF-α表达较TXL组显著增高(P均<0.01)。结果提示,TXL调节TNF-α和P-selectin的作用受PKA通路调节,而TXL抑制无再流区P-selectin的作用弱于IPC和SIM。心肌组织水肿检测显示：TXL组左心室含水量和再流区组织含水量较梗死组分别降低了1.47%和5.06%(P均<0.05),而H-89消除了TXL的作用。TXL组再流区CSA较梗死组低20.97%(P<0.01),而TXL+H-89组再流区CSA较TXL组高1.14倍(P<0.05)。TXL组再流区和无再流区MSA较梗死组分别低48.5%和53.5%,而TXL+H-89组分别较TXL组高1.4倍和1.6倍(P均<0.05)。在再流区,TXL组AQP-8表达低于梗死组(P<0.01),而TXL+H-89组AQP-8表达又低于TXL组(P<0.01)；在无再流区,TXL组AQP-1和-9表达低于梗死组(P均<0.05),而TXL+H-89组AQP-9表达较TXL组增高(P<0.001)。结果表明,TXL减轻心肌水肿的作用与通过PKA通路调节AQPs表达有关；虽然TXL抑制AQP-4、-8和-9的作用弱于IPC和SIM,但TXL减轻心肌水肿的作用不次于IPC和SIM。心肌细胞凋亡检测显示：TXL组再流区和无再流区心肌细胞凋亡指数分别较梗死组降低了55.9%和25.1%(P均<0.001),而TXL+H-89组无再流区心肌细胞凋亡指数较TXL组高1.2倍(P<0.05)；IPC, SIM和TXL三者对缺血区心肌细胞凋亡指数的影响无显著差异(P均>0.05)。与梗死组比较,TXL组Bcl-2表达增加,Bax表达降低,Bcl-2/Bax比值增高(P均<0.05),而H-89消除了TXL的作用。结论：1.在猪AMI前1小时给予单次负荷剂量TXL预处理,可以明显改善再灌注后心肌无再流和再灌注损伤,与保护微血管内皮结构和功能、减轻炎症反应、减轻心肌水肿和细胞凋亡有关；2.TXL的心脏保护作用部分受PKA通路调节；3.IPC、SIM和TXL三者中,IPC的心脏保护作用最好,TXL次之,SIM最差。