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目的:应用膜片钳技术,探索运动应激对大鼠心室肌细胞L型钙离子通道的影响,并结合免疫组化的方法推测其可能存在的细胞内机制。方法:Wister大鼠20只,采自于河北医科大学实验动物中心,合格证号(1502056),体重200-250g,雌雄不限,随机分为3个实验组:对照组(不给于运动干预)、实验组:运动应激组和运动应激+药物干预(每次运动前30min皮下注射salubrinal)。实验组大鼠头部负重(5%体重)运动9天。实验前3天,为动物适应性训练期,运动应激组+药物干预组皮下注射用二甲基亚砜做溶剂的Salubrinal(1mg/kg),其余2组给予同等剂量的二甲基亚砜。随后的9天实验中,给予大鼠皮下注射Salubrinal(0.5mg/kg),运动后动物休息1天,继而对大鼠进行急性心肌细胞分离、膜片钳记录L型钙离子电流和免疫组化进行内质网应激标记物水平的分析。大鼠心室肌细胞的分离:Wister大鼠,腹腔注射普通肝素5000U/Kg,20min后腹腔注射1%戊巴比妥1ml/Kg;待麻醉完成后迅速开胸,取出心脏;置于4℃无钙台式液中冲洗后转入4℃无钙台式液培养皿中,游离主动脉根部,插入主动脉套管,安置于Langendorff灌流装置上;以无钙台式液8-10ml/min的灌流速度,灌流5-7min后,改用消化酶液灌流20min,灌流温度37℃,流速8-10ml/min。将心脏从Langendorff装置上取下,置于37℃KB液中温育5-10min;剪去心房和右心室,留取左心室游离壁,将左心室组织剪成2mm×2mm×2mm的碎块,用粗开口巴氏吸管缓慢吹打5min。用200μm的微孔尼龙膜过滤。滤液于室温下静置30min,显微镜下观察到上清液中多为死亡的心肌细胞或悬浮的细胞碎片时去除上清,加入KB液,重复3次,置于4℃保存备用。细胞存活率的测定:2ml巴氏吸管吸取1ml的细胞悬浮液,滴于载玻片上,滴入1滴0.2%的台盼蓝染色,死亡的心室肌细胞会被染成淡蓝色。存活的细胞仍然会保持透亮,光滑的状态。存活率(%)=活细胞数/(活细胞数+死亡的细胞数)×100%免疫组化:Western blot取分离好的心室肌细胞放入2.5ml离心管中,置于4℃离心机中12000转/分离心15分钟。充分弃上清液,加入裂解液50μl,4℃裂解30min后加入1:5上样缓冲液,置于100℃的水浴锅中煮沸10min。采用BCA法进行蛋白定量后,进行上样开始SDS-PAGE凝胶电泳,完成电泳后将分离好的蛋白转膜至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭1小时后,分别孵CHOP、phospho-e IF2α和caspase-12一抗置于4℃,10小时后,PBS洗脱一抗,孵二抗(HRP-conjugated antirabbit immunoglobulin G antibod),1小时后开始ECL发光,并用G-BOX检测结果。应用全细胞膜片钳技术,记录急性分离的大鼠心室肌细胞L型钙离子通道。用巴氏吸管吸取数滴心肌细胞的悬液置于倒置显微镜的灌流槽中,静置5min待细胞贴壁后,利用记录钙离子的细胞外液(钙外液)灌流(2ml/min)冲掉死亡的心肌细胞,选取贴壁较好、纹理清晰、边缘整齐、透亮、静止不动且表面光滑的心肌细胞做全细胞膜片钳记录,电极为硬质玻璃材质(武汉微探极生产),经过水平拉制仪(Sutter P-97 USA)四步拉制而成。然后用抛光仪(Narishige Scientific Instrument Lab.,Tokyo,Japan)对拉制好的微电极进行抛光处理。电极充灌钙离子通道极内液。安装于膜片钳的夹持器上针筒给予正压,操纵三维操纵器移动电极至电极贴于细胞表面,释放正压并适当给以负压,使细胞与电极形成高阻封接(≥1G?)。调节快速补偿,以抵消夹持器和电极管壁的快电容。继续给予负压吸破细胞膜,形成全细胞记录,调节慢电容和串联电阻以减少瞬时充放电时的电流钳位误差。脉冲信号由patchmaster软件予以控制,通道信号由EPC-10(HEKA,Germany)膜片钳放大器记录并由patchmaster软件对数据进行采集。实验在20-25℃的室温条件下进行,全细胞形成后稳定2min后进行数据的采集。结果:1与对照组(n=4)相比运动应激组(n=4),内质网应激标记物phospho-e IF2α(1±0.50 Vs 2.31±0.87,P=0.04)、CCAT/enhancer-binding homologous protein(CHOP)(1±0.30 Vs 3.13±1.20,P=0.034)和caspase-12表达均升高(1±0.44 Vs 2.6±0.84,P=0.014)并且存在统计学差异,推测运动应激触发了内质网应激的机制。与对照组(n=12)相比运动应激组(n=9)的L型钙离子通道电流密度峰值明显减低(-3.80±1.26 Vs-2.24±1.11,P=0.009)说明运动应激可以降低L型钙离子通道电流。而这种降低可以被选择性的e IF2α去磷酸化抑制剂salubrinal所阻断,对照组(n=12)与运动应激+salubrinal组(n=7)的L型钙离子通道电流密度峰值变化没有统计学差异(-3.80±1.26 Vs-3.82±1.49,P=0.979),运动应激组(n=9)与运动应激+salubrinal组(n=7)相比L型钙离子通道电流密度峰值明显减低(-2.24±1.11 Vs-3.82±1.49,P=0.03)。而salubrinal通常用于内质网应激的抑制剂,这就提示内质网应激可能参与了对L型钙离子通道电流的调节;2试验中发现对照组(n=7,points=49),运动应激组(n=9,points=63)和运动应激+salubrinal组(n=12,points=84),运动应激前后半数激活电压(-21.06±1.07m V Vs-19.39±1.64m V Vs-17.69±1.26m V,P=0.96)的改变不存在统计学差异;对照组(n=7,points=42),运动应激组(n=8,points=48)和运动应激+salubrinal组(n=12,points=72)运动应激前后半数失活电压(-29.51±0.18 m V Vs-27.01±0.40 m V Vs-27.21±0.44 m V,P=0.98)的改变不存在统计学差异。结论:1运动应激后电压依赖性L型钙通道的电流减小。2运动应激导致了内质网应激。3内质网应激参与了运动应激对于L型钙离子通道的调节。