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背景和目的:线粒体基因组(mitochondrial genomes,mt-genomes)是除病毒基因组外生物圈中最经济的DNA配置形式。人线粒体DNA(mitochonrial DNA, mtDNA)为一长度为16569bp的环状双链分子,基因组包含2个rRNA基因,22个tRNA基因和编码氧化磷酸化复合物体系中13种多肽的mRNA基因,所有基因无间断地排列,基因之间没有非编码区,它的非编码区集中在16024bp和576bp之间共计1122bp,称为D环(displacement-loop, D-loop),它调控整个线粒体DNA的复制和转录。由于线粒体基因组缺乏组蛋白的保护和有效的DNA修复系统以及长期处于氧化磷酸化产生的氧自由基的环境中,线粒体基因组具有较高的突变率,大概是核基因组的10倍。位于D环区核苷酸序列16024-16324位和63-322位的两个片段称为两个高变区(hypervariable region,HV),分别记为HVⅠ(first hypervarible regioin)和HVⅡ(second hypervarible region)。高变区的碱基突变率比核基因组高100-200倍,这可能和下列原因有关:①D环是mtDNA和线粒体膜的结合位点,受脂质过氧化物的影响很大;②线粒体DNA不同步的D环复制形式导致了控制区局部形成三链结构,其单链的构造使其更易受到过氧化物的损害。近十年的研究发现线粒体基因组的缺陷和衰老、肿瘤、神经退行性疾病、肌病、心肌病以及糖尿病的关系密切。肿瘤细胞通常存在大量的核苷酸改变。虽然线粒体基因组的碱基突变率是核基因组的10倍,但长期以来,在肿瘤的研究方面,研究者主要集中于核基因组的改变,而相对忽略了线粒体基因组的变化。近年来研究发现线粒体在细胞凋亡过程中起重要作用,于是人们开始探索mtDNA变化与肿瘤的发生、发展之间的关系,并且在多种肿瘤中发现了线粒体DNA的突变。骨肉瘤是原发性骨肿瘤中最常见的恶性肿瘤,约占所有骨肿瘤的20%,多发生于青少年。人们发现多种癌基因的扩增、重组和点突变与骨肉瘤的发生、发展密切相关,而涉及线粒体基因组变异的研究很少。本研究通过检测骨肉瘤组织mtDNA控制区、ATPase6基因和Cytb基因序列,了解骨肉瘤组织mtDNA基因变异,探讨线粒体基因突变与肿瘤发生的关系。方法:本课题应用PCR-RFLP分析、PCR产物直接测序、并结合光镜、电镜观察等方法对人骨肉瘤组织线粒体DNA控制区、ATPase6基因和cytb基因的碱基组成改<WP=10>变规律进行初步探讨。结果:20例骨肉瘤组织mtDNA控制区均发生突变,阳性率为100%(20/20)。 位于线粒体DNA 16024bp-16324bp 间的HVⅠ区的301bp区段中出现了59个碱基差异位点, 占整个控制区碱基差异总数的51.6%;位于线粒体DNA 63bp-322bp间的HVⅡ区的259bp区段中出现了15个差异位点,占整个控制区碱基突变总数的31.5%。即83.1%的碱基改变发生在高变区。骨肉瘤mtDNA ATPase6基因突变阳性率为65%(13/20)。发现23个突变位点,其中4个为移码突变,19个为碱基置换突变(同义突变7个,错义突变12个)。骨肉瘤mtDNA Cytb基因突变阳性率为50%(10/20)。发现13个突变位点,其中7个为移码突变,6个为碱基置换突变(同义突变和错义突变各3个)。3个位点的突变发生率较高:nt 14783 T→C突变,为70%(14/20);nt 15043 G→A突变和nt 15301 G→A突变,均为75%(15/20)。结论:20例人骨肉瘤组织mtDNA控制区共检测到34个新的突变,而高变区碱基变异率显著高于控制区其它区域碱基变异率。mtDNA控制区高变区可能是骨肉瘤碱基突变的热点,该区突变可能在骨肉瘤的发生,发展中发挥重要的作用。20例人骨肉瘤组织mtDNA ATPase6基因共检测到23个新的突变,这些突变将对ATPase6基因编码的蛋白质的结构和功能产生一定的影响,从而影响线粒体的氧化磷酸化功能。新突变的特异性及意义尚有待进一步研究。20例人骨肉瘤组织mtDNA Cytb基因共检测到13个新的突变,并有3个突变热点:nt 14783 T→C突变,nt 15043 G→A突变和nt 15301 G→A突变;这3个突变可能和线粒体的损伤相关,它们可能为骨肉瘤的诊断和线粒体功能评价提供有价值的参考。骨肉瘤各亚型之间在mtDNA控制区、ATPase基因和Cytb基因的碱基突变率无显著性差异,各亚型在形态学上的差异可能是由线粒体DNA其它区域或核基因组的改变引起的。