牙周炎是口腔常见病，是成人牙齿丧失的主要原因之一。吸烟是牙周炎的重要危险因素。在烟草的毒性物质中，烟碱即尼古丁是其主要成分，为生物碱。吸烟者较不吸烟者牙周炎的患病率高、病情重。大量研究表明：吸烟与牙周袋形成、附着丧失、骨丧失及牙齿丧失有关。牙周炎的发生发展存在牙周组织破坏和再生修复两种相互交替的过程，而尼古丁对牙周炎的影响也在于加速牙周组织破坏抑制再生修复从而使得较之于非吸烟者而言，吸烟者的病情更加严重。同时，尚可使吸烟者经系统性牙周治疗的预后较差。目前对于尼古丁相关性牙周炎的研究主要集中于对牙周组织的破坏层面，对于其抑制再生修复的原因及机制，鲜有文章报道。牙周膜组织中存在具有形成细胞克隆能力的牙周膜干细胞（PDLSC）。牙周膜干细胞具有干细胞的基本特性，在成骨诱导条件下有向成骨方向分化的特定趋势；实验性大鼠牙周炎动物模型证实，PDLSC能在体内形成具有牙周膜-牙骨质复合体样的结构伴穿通纤维走行其中，因此人牙周膜干细胞具有修复牙周缺损和形成牙周新附着的潜能。本课题体外研究尼古丁对PDLSC成骨能力的影响，检测PDLSC是否表达尼古丁特异性受体α7nAChR并探讨此受体及其下游信号通路是否参与尼古丁对PDLSC成骨分化的负性调控作用。以期完善尼古丁对牙周炎不良影响的作用机制，为临床治疗新途径提供实验依据。实验一：人牙周膜干细胞分离培养和鉴定本实验采用有限稀释法对PDLSC进行分离培养，流式细胞仪检测其表面抗原标志物；同时给予一定诱导微环境，观察其定向分化潜能，以期为后续实验提供理想的种子细胞。结果提示：有限稀释法可自人牙周膜细胞中成功提纯hPDLSC克隆，所得细胞阳性表达间充质来源干细胞表面分子抗原标志物且在一定诱导微环境下具有成骨和成脂分化潜能。说明所得细胞具有干细胞基本特性，来源可靠。实验二：尼古丁对人牙周膜干细胞形态和增殖能力的影响本实验体外培养PDLSC，分别给予梯度浓度尼古丁，观察一定作用时间后细胞形态和增殖能力的改变，为后续实验摸索适宜的尼古丁作用浓度。结果提示：不同浓度尼古丁均可对细胞形态产生影响并抑制PDLSC增殖能力，且尼古丁对细胞增殖能力的抑制呈浓度依赖性。说明尼古丁对PDLSC具有细胞毒作用，合适的作用浓度是开展后续体外实验的必要条件。实验三：尼古丁对人牙周膜干细胞成骨分化能力的影响本实验观察了尼古丁对PDLSC成骨分化能力的影响，以期解释吸烟者牙周再生情况较差的原因，为临床治疗提供理论依据。结果提示：不同浓度尼古丁均可抑制PDLSC早期和终末期成骨分化且具有浓度依赖性。尼古丁可抑制成骨相关因子ALP、BSP、OCN和Runx2基因及蛋白的表达。说明其对PDLSC成骨分化具有负性调控作用。实验四：α7nAChR在PDLSC中的表达及其所介导的尼古丁对细胞成骨的负性调控作用本实验旨在探讨PDLSC中α7nAChR的表达并进一步明确该受体是否介导尼古丁对PDLSC骨向分化的负性调控作用。结果提示：PDLSC中存在α7nAChR基因和蛋白的表达；组织学染色进一步证实通过给予α-BTX竞争性拮抗尼古丁与受体的结合，可在一定程度逆转尼古丁的负性调控效应。基因和蛋白结果提示当尼古丁同受体的结合被拮抗后，PDLSC成骨相关基因和蛋白的表达同尼古丁作用组相比也出现上调。说明PDLSC中存在α7nAChR介导的尼古丁对PDLSC成骨的负性调控作用。实验五：Wnt信号通路在尼古丁影响人牙周膜干细胞成骨能力中的作用本实验旨在探讨尼古丁同α7nAChR结合后下游是否存在Wnt信号通路的表达变化并进一步明确该通路是否参与了尼古丁对PDLSC骨向分化的负性调控作用。结果提示α7nAChR激活后下游存在Wnt信号通路相关转录因子蛋白的表达变化；组织学染色进一步证实Wnt信号通路抑制剂Dkk1可在一定程度逆转尼古丁对PDLSC成骨的负性调控。基因和蛋白结果提示当Wnt信号通路被抑制后，PDLSC成骨相关基因和蛋白的表达同尼古丁作用组相比也出现上调。说明α7nAChR下游存在Wnt信号通路的激活且在PDLSC中Wnt信号通路抑制了成骨分化。