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异体造血干细胞移植(allo-HSCT)因具有移植物抗白血病(GVL)效应,移植后复发率低;但移植物抗宿主病fGVHD)及感染等并发症发生率高,致使移植相关死亡率高,且由于存在HLA配型相合问题,大部分患者无行异体造血干细胞移植治疗的可能,致使临床应用受限。自体造血干细胞移植(auto-HSCT)丌展已近40年。它虽不受配型限制,并发症较轻,但因缺乏GVL效应而复发率较高。复发是自体造血干细胞移植失败的重要原因,减少复发成为提高疗效的关键。我们以往的研究证明,以自体为主,混合HLA半相合异体造血干细胞的干细胞移植(混合造血干细胞移植,mixed-HSCT)可在一定程度上兼有两者的优点,克服其不足,诱导形成混合嵌合体,减轻GVHD,同时保留GVL效应。鉴于此,本课题从动物实验入手,应用含有标记基因的K562细胞和BALB/C小鼠制备白血病小鼠模型;应用基因标记技术进行动物实验,探讨以自体为主,混合H-2半相合异体造血干细胞的干细胞移植(即混合造血干细胞移植)及移植后应用供体淋巴细胞输注联合IL-2治疗急性髓性白血病的疗效和嵌合体形成情况,为临床应用提供依据;并应用于临床实践,观察该方法对成人急性髓性白血病的治疗效果。1.研究内容及方法:(1)K562细胞株的基因转移:培养PA317-GCGPXSN和NIH3T3及K562细胞株;应用PA317。GCGPXSN细胞株制备病毒上清,NIH3T3细胞株测定病毒滴度;应用rhIL-3、rhIL-6及rhSCF刺激K562细胞株后,实施基因转移;应用流式细胞仪测定基因转移效率及PCR方法测定NeoR基因,将完成基因转移的K562细胞株命名为K562+细胞株。(2)BALB/C小鼠模型制备:SPF级BALB/C小鼠按实验分组后分别经直线加速器照射2GY和3GY,24小时后取对数生长期的K562+细胞按实验分组以尾静脉一次性注射K562+细胞。观察小鼠的一般情况及生存时间、骨髓细胞分类及外周血白细胞计数、分类、细胞亚群及相关脏器病理检查、流式细胞仪测定K562+细胞、PCR方法测定组织浸润情况。(3)常规方法培养BALB/CxC57BL F1代小鼠骨髓细胞,并应用流式细胞仪测定T亚群及NK细胞,CD34+细胞。在经过PHA,rhIL-2,rhIL.3、rhIL-6及rhSCF刺激后实施基因转移,应用流式细胞仪测定基因转移效率,PCR方法测定NeoR基因。将完成基因转移的F1代细胞命名为F1+细胞。(4)动物实验:用上述方法制备白血病小鼠模型,按实验分组。7天后做6Gy照射,照射后24小时做自体骨髓移植或混合骨髓移植,混合移植间隔1小时。混合移植组每7天输F1代细胞一次,应用IL-2者隔日腹腔注射一次。观察4周后杀死存活小鼠,做外周血及骨髓细胞形态检查,细胞亚群测定,GFP+细胞测定,NeoR基因测定,肝脏、脾脏病理学检查及组织匀浆细胞的GFP+细胞和NeoR基因的测定。(5)13例急性髓性白血病患者在完全缓解期实施了Mixed-HSCT,于造血恢复后,给予DLI联合IL-2治疗2-7次:另有11例急性髓性白血病患者在同样条件下实施Mixed-HSCT,移植后未予特殊治疗。2.实验结果:(1)K562细胞基因转移效率K562-细胞应用流式细胞仪测定的荧光强度数值为0.56%,K562+细胞荧光强度为77.16%。两者差异显著(P＜0.01)。PCR方法扩增到了NeoR基因的特异性片断,说明含GFP和NeoR基因的逆转录病毒载体质粒已转移并整合进入K562细胞的基因组中。(2)白血病模型制备情况①照射对小鼠免疫功能的影响E组小鼠经2Gy照射后外周血CD3、CD4、CD8、CD16+CD56+细胞呈进行性降低,至第3周开始出现逐渐恢复迹象,4周后恢复正常。F组在3GY照射后CD3、CD4、CD8、CD16+CD56+细胞呈进行性降低,至第4周开始出现逐渐恢复迹象,5周后恢复正常。在同一时间,3GY照射较2GY照射所导致的细胞亚群降低的程度更为明显(P＜0.05)。脾、胸腺在照射后外观较正常小鼠缩小,重量减轻并延续至4周才基本恢复至照射前的水平,肝脏重量无明显变化。②发病情况照射2、3GY后未接种K562+细胞的BALB/C小鼠(E、F组)观察4周未出现自然死亡。照射2、3GY后分别接种K562+细胞2x10~6、5x10~6的BALB/C小鼠(A、B、C、D组)在接种5-7天时发病。A组于30天内全部死亡;C组于24天内全部死亡;B组于23天内全部死亡;D组于17天内全部死亡;各组小鼠生存天数有显著性差异,均显著短于正常对照组(P＜0.01)。体重均较正常对照组显著下降(P＜0.01)。小鼠的白血病发病率为100%,无自发缓解。随着接种白血病细胞数量的增加和照射剂量的增加,小鼠的存活时间逐渐缩短,且外周血及骨髓中人原、早幼粒白血病细胞所占比例逐渐增加。病理学检查证实有肿瘤细胞浸润。流式细胞仪测定结果与此相一致,PCR方法也证实了NeoR基因的存在。(3)F1代细胞基因转移效率F1(-)细胞应用流式细胞仪测定的荧光强度数值为0.63%,F1(+)细胞荧光强度为76.04%。两者差异显著(P＜0.001)。PCR方法扩增到了NeoR基因的特异性片断,说明含GFP和NeoR基因的逆转录病毒载体质粒已转移并整合进入F1(+)细胞的基因组中。(4)小鼠骨髓移植实验①骨髓移植细胞数目测定实验组小鼠移植自体骨髓细胞中,CD34+细胞为1.32%,CD3+细胞26.56%,CD4+细胞13.44%,CD8+细胞3.09%,CD16+CD56+细胞7.53%。移植异体骨髓细胞(F1+)中,CD34+细胞为1.51%,CD3+细胞61.41%,CD4+细胞39.57%,CD8+细胞27.61%,CD16+CD56+细胞9.59%;移植异体骨髓细胞(F1-)中,CD34+细胞为1.49%,CD3+细胞65.86%,CD4+细胞40.13%,CD8+细胞19.16%,CD16+CD56+细胞9.70%;其中F1(+)与F1(-)细胞各亚群之间没有明显差别(P＞0.05),即每只实验鼠所移植的各类细胞数目没有明显差别。②各实验组疗效观察白血病小鼠模型组(A组)在20天内全部死亡,白血病小鼠模型经6GY照射后(F组)在14天内全部死亡,在濒死小鼠骨髓及外周血中均检测到GFP及NeoR基因。A组濒死小鼠外周血及骨髓见11%-64%不等的原、幼稚细胞。F组濒死小鼠外周血及骨髓细胞稀少,主要为淋巴细胞。A组和F组濒死小鼠骨髓及外周血中均检测到GFP及Neo基因的存在。两组濒死小鼠外周血T细胞亚群及NK细咆均极低。其它实验组小鼠均有6-3只不等的小鼠存活时间＞28天,存活的小鼠外周血及骨髓细胞数量及形态同正常小鼠,外周血T细胞亚群及NK细胞已恢复至正常范围,各组之间无明显差别(P＞0.05)。在存活小鼠中输注F1(+)细胞者检测到了GFP及Neo基因。存活小鼠肝、脾检查未发现肿瘤细胞在肝、脾组织中的浸润及充血等现象。俎织匀浆细胞的GFP和NeoR基因的测定中未检测到GFP+细胞,亦未扩增到特异性的Neo基因片段的存在。证明K562+的肿瘤细胞在存活小鼠的肝、脾中消失。(5)临床疗效观察混合造血干细胞移植患者均获得造血重建。无GVHD发生。观察组中有3例M2a患者在接受1、2、2次DLI+IL-2治疗后+3、+4、+7月复发死亡。1例M2a患者接受2次DLI+IL-2治疗后,于+1年时出现MDS,死于脑出血。1例M5患者应用DLI+IL-2治疗1次后出现不明原因高热、抽搐,死于癫痫持续状态。其余8例患者随访1-5年均无病存活。其中1例M4、1例M5患者有嵌合体形成。长期生存率为61.5%(8/13例)。对照组有2例M2a,2例M4,1例M5于移植后+1-+7月复发死亡,1例M3患者于+25天死于脑出血。其余2例M3,2例M4,1例M5随访3-5年均无病存活。其中后3例均有嵌合体形成。长期生存率为45.4%(5/11例)。3.结论:(1)含有GFP基因和NeoR基因的逆转录病毒成功地转移进入K562细胞株和BALB/CxC57BL F1代小鼠骨髓细胞中。(2)BALB/C小鼠经照射后从尾静脉注射K562细胞株可以制备获得白血病小鼠模型。(3)白血病小鼠在经过混合造血干细胞移植后给予DIL联合IL-2治疗,可以提高长期生存率。(4)临床应用证实,应用混合造血干细胞移植治疗,在移植后给予DIL联合IL-2过继免疫治疗,可以提高急性髓性白血病患者的长期生存率。