前言本课题组前期从手术切除的15例小细胞肺癌及淋巴结转移癌标本中,筛选和克隆出与肺癌转移相关的3个基因片段(C1、L1、L2),经同源序列分析后发现3个片段均位于肿瘤高度相关的3、4、7和10号人类染色体上,其中L1有2个同源序列,L2有5个同源序列,C1有2个同源序列,L1、C1、L2均为未知序列,皆由肺癌标本中筛选和克隆出来的,推测可能与肺癌转移相关,故作为肺癌转移相关候选基因进行研究。本研究目的就是对这3个基因片段中进一步筛选,克隆其基因全长,明确基因性质后,再构建针对人的该基因siRNA表达质粒,使基因沉默,观察该基因以及其对95-D肺癌细胞株增殖、转移能力的影响,为进一步研究该基因功能奠定基础。ABCE1基因是保守的ABC基因家族中最保守的基因之一,最近报道,ABCE1基因在脊椎动物的翻译起始中起重要作用,而翻译作为肿瘤的发生、发展过程中起作相当重要的作用。近期发展起来的RNA干扰技术具有几乎无细胞毒性、稳定性强、高效特异抑制靶基因等特点,为特异地抑制目的基因表达提供了有效的方法。在本实验的第一部分,我们应用从四种肺癌手术标本、3种肺癌细胞株中筛选克隆出L2基因全长序列,该基因即为ABCE1基因。本实验的第二部分应用DNA重组技术构建了ABCE1特异性siRNA表达质粒RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express与其他基因治疗技术相比,siRNA技术具有明显的优势。本实验第三部分利用ABCE1特异性siRNA表达载体转染肺癌细胞系95-D,评价其对95-D细胞生长的抑制作用,并评价其对增殖、凋亡相关信号转导通路表达的影响,同时检测95-D细胞中黏附因子E-cad和β-cat表达情况,推测ABCE1基因对肺癌细胞95-D的转移、浸润能力,为利用研究ABCE1与肺癌转移的相关性提供实验依据。材料与方法一、材料(一)标本细胞株1、标本:四种肺癌标本均来源于中国医科大学第一临床医学院胸外科2006年3月-6月的手术切除的肺癌标本;其中小细胞肺癌病灶标本1例,小细胞肺癌淋巴结转移病灶1例,肺腺癌病灶标本1例,低分化鳞癌转移淋巴结病灶1例。2、细胞株:人肺腺癌细胞株95-D、小细胞肺癌细胞株NCI-H292、NCI-H446均购自中科院上海细胞所。(二)、主要试剂mRNA提取试剂盒、RACE cDNA扩增试剂盒、PCR试剂盒、Trizol试剂、M-MuLV逆转录酶、T4 DNA连接酶、BstZⅠ限制性内切酶、胰蛋白酶、G418(Gibco-BRL)、转染试剂FUGENE6、ELISA试剂盒、MTT试剂盒、兔抗人上皮性钙砧附蛋白单克隆抗体((4A2C7)、兔抗人β-连接素单克隆抗体(CAT-SH 10)、即用型SP试剂盒、DAB试剂盒等。二、方法1、三种肺癌细胞株及四种肺癌手术标本总RNA的提取。2、运用RT-PCR技术中,对肺癌转移相关基因C1,L1,L2片段进行验证,钓取目的片段。3、运用RACE(cDNA末端快速扩增)技术克隆出其基因全长序列,并登录Genbank,进行序列比对,确定克隆的基因性质。4、根据ABCE1基因,设计发卡结构序列长度为71bP的两对有效干扰和一对负对照的反向重复序列,其两端带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点,中间被9bp环结构分割。并以6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子,形成BamHⅠ子Sense+Loop+Antisense+终止信号+HindⅢ的结构。5、将合成的两对单链正义siRNA转录模板和单链反义siRNA转录模板及一对阴性对照转录模板变成双链。6、与线性质粒RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express连接。7、转化大肠杆菌中扩增,测序鉴定。8、运用转染试剂FuGENE 6对三种不同的ABCE1基因SiRNA表达质粒在95-D肺癌细胞中进行转染。9、用G418筛选,荧光显微镜观察三种质粒的转染效果,收集转染的细胞,计数转染细胞的总数、运用MTT法检测细胞活力。10、用ELISA法检测细胞凋亡。11、用免疫组化检测E-cad和β-cat在干扰组与对照组细胞中的表达情况。结果1、在NCI-H446细胞和95-D细胞中未得到C1和L1基因目的大小片段,只有L2基因目的片段。2、从两种细胞株中均得到L2基因的3′端部分未知序列1169bp;从NCI-H446细胞中得到L2基因的5′端未知序列178bp,从95-D细胞中145bp。3、L2基因序列与已知的ABCE1基因序列同源性100%。4、转化大肠杆菌涂布平板长出阳性菌落,重组质粒电泳初步说明质粒构建成功。5、测序结果表明RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express的酶切位点BamHⅠ、HindⅢ之间有71bp的插入片段,其序列与所设计、合成的ABCE1的siRNA转录模板序列一致。6、转染的细胞表达红色荧光蛋白,三种质粒中均有表达,但Si-1质粒表达效果强于Si-2和Si-N。7、干扰组的细胞增殖低于对照组、而细胞凋亡高于对照组,差异显著(p＜0.05)。8、干扰组细胞中E-cad和β-cat的表达明显增多,与对照组相比差异显著(p＜0.05)。结论1、从已知的三个片段C1、L1、L2中,成功筛选出L2基因即ABCE1基因。2、SiRNA转录模板完整正确地插入RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express载体中,成功构建ABCE1基因的RNAi质粒。3、ABCE1基因能增强95-D肺癌细胞转移、浸润能力。