心肌肥厚、心力衰竭(简称心衰)常常伴发室性心律失常,心衰病人约一半以上因恶性心律失常的发生而猝死(即心性猝死Sudden cardiac death,SCD)。心肌肥厚、心衰时发生病理性电生理重构,一个主要特征是动作电位时程(action potential duration, APD)的延长。不同的原因所致的多种心肌肥厚和心衰的实验动物模型及人的心室肌细胞均观察到K+电流的下调。肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)在心肌肥厚的病理过程中具有重要作用,血管紧张素II是该系统发挥主要作用的体液因子。已知血管紧张素II是造成心脏组织肥厚性重构的重要原因,然而关于AngII在心肌电重构、心律失常产生中的作用了解很少。越来越多的动物实验表明,肾素-血管紧张素系统在房性和室性心律失常的病理过程中具有重要作用。在急性分离的大鼠和犬的心室细胞、及表达编码Ito通道基因KV4.3的哺乳细胞上,AngII均可减小Ito电流密度。实验表明,选择性心肌组织过表达AngII基因的小鼠在不增加循环AngII水平的情况下出现明显复极化延迟,伴高发的室性心律失常;与上述结果相似,Rivard等新近报道,心脏特异性过表达人类AT1受体基因小鼠的Ito、IKur (一种超快激活的延迟整流K+电流)及IK1均下调,造成复极延迟,动作电位延长,伴自发室性心律失常。特别值得注意的是,年幼的转基因动物即存在复极化延迟及高发的心律失常,而此时并不存在组织肥厚性重构,表明电生理改变并非继发于肥厚性重构,而是刺激AT1受体直接引起离子通道的改变。这些研究提示,AngII直接对离子通道的调节作用可能是病理性电重构的重要因素。延迟整流钾电流IK是哺乳动物和人的心室肌细胞动作电位主要的复极外向钾电流,包括缓慢激活的延迟整流钾电流(IKs)和快激活的延迟整流钾电流(IKr)。目前认为,IKs通道分子是由4个KCNQ1成孔道基因(α-亚单位)及2个辅助KCNE1(β-亚单位)组成。KCNQ1和KCNE1突变分别与I型(LQT1)和V型(LQT5)先天性QT间期延长综合征有关。心肌肥厚、慢性心力衰竭和心肌梗塞等引起的电重构,往往伴随着IKs的减少,这就大大增加了致死性室性心律失常的发生。前期我们报道了,AngII通过激动AT1受体抑制豚鼠心室细胞IKr电流,此作用主要由细胞内PKC信号通路中介。然而AngII对心室肌IKs的调控作用尚不清楚。本实验利用全细胞膜片钳技术,在急性分离的豚鼠心室肌细胞及表达通道α、β-亚单位cDNA的人胚胎肾细胞(HEK293)上,观察了AngII对心室肌IKs的直接调控作用,并分析了其作用的细胞内分子机制。第一部分Ang II抑制心室肌细胞的缓慢激活延迟整流钾(IKs)电流目的:观察AngII对豚鼠心室肌细胞IKs的影响。方法:在急性分离的豚鼠心室肌细胞,常规全细胞膜片钳技术记录IKs电流,观察AngII对IKs影响。结果:外液中加入AngII(100 nM)后,明显减少了去极化外向电流及复极时的尾电流,当去极电压为+40 mV时,尾电流由给药前的0.77±0.07 pA/pF减小到0.49±0.07 pA/pF。抑制作用2-3 min出现,5-10 min左右达到稳态,电流的抑制作用冲洗后不能完全恢复。AngII以浓度依赖方式抑制IKs,以IKs尾电流抑制率为纵座标做出AngII抑制IKs的量效曲线,经Hill方程拟合后得到IC50=8.2923 nM。AngII对电压门控IKs通道半数激活电压、激活及去激活时间常数都没有影响。小结:AngII抑制豚鼠心室肌的IKs电流,这种抑制作用与通道的动力学特征无关。第二部分AngII通过PKCε亚型调节IKs电流目的:观察AngII对豚鼠心室肌细胞IKs抑制作用的细胞内信号转导通路。方法:在急性分离的豚鼠心室肌细胞上,全细胞膜片钳技术记录IKs电流,观察不同的PKC抑制剂或激活剂对AngII抑制IKs作用的影响。结果: AT1受体阻断剂Losartan(1μM)几乎完全取消AngII对IKs电流的抑制作用,而AT2受体阻断剂PD 123319(1μM)则不影响AngII的作用。PKC抑制剂Bis-1(100 nM)和stausporine(100 nM)明显减弱AngII对IKs电流的抑制作用;PKC激动剂PMA(100 nM)也明显减弱AngII对IKs电流的抑制作用;细胞内Ca2+螯合剂BAPTA(20 mM)并不影响AngII对IKs的抑制作用;选择性PKC亚型抑制剂Go6976(100 nM,选择性抑制Ca2+敏感PKC亚型)和Go6983(100 nM,抑制传统型、新型PKCδ和非典型PKCζ,而不影响新型PKCε)不影响AngII对IKs电流的抑制作用;PKCε亚型的转位抑制剂εV1-2(100 nM)明显对抗了AngII对IKs电流的抑制作用。小结: AngII通过激动AT1受体、激活新型PKCε亚型而下调IKs通道功能。第三部分AngII对KCNQ1/KCNE1通道的影响目的:分析AngII对异源表达的KCNQ1/KCNE1通道电流影响及其分子机制。方法:采用脂质体介导瞬时转染方法,HEK293细胞共转染人KCNQ1、KCNE1及AT1受体cDNA,观察AngII对通道电流的影响。结果:在转染的HEK293细胞上,与豚鼠心室肌上观察到的结果相似,AngII激活AT1受体抑制KCNQ1/KCNE1电流,这种抑制作用可以被PKC抑制剂阻断,并且AngII不改变KCNQ1/KCNE1通道的电压依赖性激活和通道的动力学特征。AngII对单独转染α亚基的KCNQ1通道电流亦具有抑制作用,但抑制作用较对KCNQ1/KCNE1通道的抑制作用减小,和对KCNQ1/KCNE1的抑制作用一样,都未影响通道的电压门控特征。鉴于KCNQ1/ KCNE1/ KCNE2三聚体通道动力学特征最接近KCNQ1/KCNE1通道,我们观察了AngII对KCNQ1/ KCNE1/ KCNE2通道电流的影响,发现AngII对电流的抑制作用明显减弱。小结: 1. AngII通过AT1受体激活PKC途径抑制KCNQ1/ KCNE1电流。2. KCNQ1/ KCNE1通道的α和β亚基可能共同参与了Ang II对通道的调控作用。3 KCNE2可能存在AngII调控的PKC磷酸化位点,但激活此位点可能上调通道功能。结论1. AngII作用于AT1受体,经过PKC途经抑制心室肌细胞的IKs和表达的KCNQ1/KCNE1电流,AngII的抑制作用不影响通道的动力学特征;2. PKCε是中介AngII上述抑制作用的主要亚型;3. KCNQ1/ KCNE1通道的α和β亚基可能共同参与了AngII对通道的调4.控作用。本实验结果提示,AngII对IKs的直接抑制作用为病理状态下心脏Ang II水平升高引发电生理重构、从而易发心律失常提供了一个可能的解释。