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研究目的:使用小鼠胚胎干细胞报告细胞系及人诱导多能干细胞系对中药有效成分促神经分化功效进行检测,筛选出具有较强促神经分化功效的中药有效成分,为研发促内源性神经再生药物提供实验数据支持。研究方法:1.应用诱导多能干细胞技术,对从健康人与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)患者尿液中分离的人肾上皮细胞进行重编程,获得人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)系。通过碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色、体内畸胎瘤形成实验以及核型分析等,对所构建的人iPSCs进行鉴定。获取可用于促神经分化功效检测的人iPSCs细胞系。2.应用来源于小鼠的胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)报告细胞系CGR8-21uc,以非那吡啶盐酸盐作为阳性对照药物,对中药有效成分与天然产物库中464种药物促神经分化功效进行检测,应用双荧光素酶检测试剂盒,对反映细胞增殖的海肾荧光素酶表达,以及反映细胞神经方向分化的萤火虫荧光素酶表达进行检测。采用K-Means聚类对筛选结果进行聚类分析,筛选得到较阳性对照药物促神经分化功效更强的候选药物,进行后续实验。3.应用构建的健康人iPSCs,对筛选得到的药物促神经分化功效进行验证。使用单层细胞分化方案,按照确定的药物安全浓度干预细胞分化7天,随后将细胞传代至聚-L-鸟氨酸与层粘连蛋白复合包被的培养板中,继续培养7天后,对神经干细胞标志物Pax6、Nestin以及早期神经元标志物β-微管蛋白Ⅲ(Class Ⅲβ-tubulin,Tuj1)进行免疫荧光染色,定量分析神经突长度,比较药物促神经分化功效。研究结果:1.实验室所构建的健康人及AD患者iPSCs碱性磷酸酶染色阳性,多能性标志物Oct4、Nanog、Tra-1-60免疫荧光染色结果阳性,细胞移植入免疫缺陷小鼠后可形成畸胎瘤,经HE染色鉴定,存在内、中、外三胚层代表性细胞、组织,核型鉴定显示均为正常染色体核型。2.通过聚类分析,将所筛选药物分为4类,其中第一类为促进神经分化而对细胞增殖无影响药物,筛选得到此类药物中较阳性对照药物促神经分化功效更强的药物9种。3.免疫荧光染色结果显示QCJ干预组未出现Nestin与Pax6双阳性神经干细胞(Neural stem cells,NSCs);其余药物干预组均出现花环样Nestin与Pax6双阳性神经干细胞;神经突定量分析结果显示,MBHS与DDG能够显著促进诱导多能干细胞向成熟神经元方向分化。结论:本实验室构建的健康人及AD患者尿液肾上皮细胞来源的iPSCs具有正常的多向分化功能。应用小鼠ESCs报告细胞系CGR8-21uc筛选得到9种具有较强促神经分化功效药物。应用人iPSCs对9种药物促神经分化功效进行验证,发现MBHS与DDG具有较强的促人iPSCs向成熟神经元方向分化功效。