论文部分内容阅读
人乳头瘤病毒(HPV,human papillomavirus)是一种常见的小DNA双链病毒,其基因组大小约为8kb,主要感染上皮黏膜细胞,可引起良性乳头瘤病变和恶性肿瘤,高危型HPV在子宫颈癌组织中的检出率可高达90%以上。大量研究资料证明,50%的宫颈癌与HPV16感染相关。目前在世界不同各地和种族已鉴定出多种HPV16变异株,并发现不同的变异株与其致病力等方面有关。新疆南部维吾尔族聚居区是宫颈癌高发区,高危型人乳头状瘤病毒16和18是宫颈癌主要病因之一,尤其以HPV16最为常见。本论文主要包括对新疆HPV16全基因组序列分析及其病毒颗粒在293T细胞包装,目的为探讨新疆HPV16变异与该地区宫颈癌高发的关系、新疆当地的宫颈癌疫苗开发和相关致癌机理研究奠定良好基础。本论文工作主要包括五部分:1、新疆维吾尔族宫颈癌患者的HPV16基因组克隆及序列分析;2、新疆株HPV16 E1多态型分析、E1核心片段的克隆及原核表达;3、新疆株HPV16 L1在真核细胞中表达水平的初探;4、密码子优化HPV16衣壳基因单价、真核共表达载体的构建及细胞转染;5、探索新疆株HPV16病毒颗粒在293T细胞中的包装。1、新疆维吾尔族宫颈癌患者的HPV16基因组克隆及序列分析根据GenBank中发表的HPV16基因的保守序列设计引物,利用LA-PCR扩增的方法,获得新疆HPV16基因组,命名为XJHPV16。测序结果表明,序列长为7963bp,其包含2606个腺嘌呤、1392个胞嘧啶、1537个鸟嘌呤、2428个胸腺嘧啶,GC含量为36.8 %,是世界上已报道的最长的HPV16。新疆HPV16E1基因内部存在63个核苷酸重复。2、新疆株HPV16 E1多态型分析、E1核心片段的克隆及原核表达从41份中国新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌活检组织标本中提取DNA ,其中有32份可以扩增出HPV16E1基因,HPV16 E1阳性率为78%(32/41)。E1基因测序和序列分析表明E1基因核苷酸多处发生变异,并引起编码氨基酸的变异;E1基因在核苷酸水平上形成11种突变模式,各模式与HPV16原型比较,同源性在96.67%～99.95%之间;在氨基酸水平上形成5种突变模式,各模式与HPV16原型比较,同源性在99.7%～100%之间,其中E1基因内部63个重复突变在世界未见报道。根据GenBank已公布E1,克隆新疆HPV16 E1核心片段,核心大小1011 bp,将核心分别构建到原核表达载体pMAL-p2x、pGEX-4T-1上,利用大肠杆菌原核表达系统进行蛋白表达,结果在大肠杆菌中成功诱导融合蛋白表达。3、密码子优化HPV16衣壳基因真核共表达载体的构建及细胞转染;用PCR技术从988载体中获得密码子优化L1,L1-IRES-L2片段,将片段克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,从而构建真核共表达载体pcDNA3.1-L1、pcDNA3.1-L1-IRES-L2;水动力转染技术(hydrodynamics-based transfection)和脂质体细胞转染法(liposome-mediated transfection of cells),检测衣壳基因的体内、外发生转录情况;pcDNA3.1-L1、pcDNA3.1-L1-IRES-L2重组质粒转染后293T细胞后发生CPE(cytopathic effect)现象,Western blot方法检测到L1衣壳基因在293T细胞中蛋白表达。4、新疆株HPV16 L1在真核细胞中表达水平的初探新疆株HPV16 L1基因发生了多位点变异,为探索新疆株HPV16 L1在真核细胞中表达水平,构建pcDNA3。1-xj-L1,转染293T细胞,Western blot无法检测到相应蛋白的表达,说明新疆株HPV16 L1与其它已报道的HPV16野生型的L1一样在真核细胞中的表达量仍然很低,这将为新疆当地的宫颈癌疫苗和相关致癌机理研究奠定良好基础。5、探索新疆株HPV16病毒颗粒在293T细胞中的包装将线性或者环化的XJHPV16单独转染293T细胞,或者与衣壳基因共同转染293T细胞,RT-PCR(reverse transcription PCR)均能够检测到病毒E2基因和E5基因的转录,Southern blot结果表明线性的XJHPV16在293T细胞重新成环,但是只有在病毒基因组(线性或环化)与衣壳基因共同转染的实验组中检测到L1蛋白的表达。实验结果表明单独转染线性或者环化的XJHPV16 ,在293T细胞无法形成病毒样颗粒,密码子优化HPV16衣壳基因是病毒颗粒形成所必需。