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目的基于OCTA研究糖网化瘀合剂对阴阳两虚证DME黄斑区微血管的影响,同时探究中药水蛭对成纤维细胞增殖的影响及相关机制。方法1.对照、横断面、观察性研究,收集2017.3-2019.3就诊于成都中医药大学附属医院眼科,明确诊断为中重度非增殖期糖尿病性视网膜病变(Non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR)患者75例,其中包括确诊为有临床意义的DME患者36例(36眼),无DME的NPDR患者39例(39眼),同期招募健康对照组38例(38眼)。所有观察者均采用国际标准视力表检查最佳矫正视力(Best corrected visual acuity,BCVA),OCT检查黄斑中心凹厚度(Central mcular thickness,CMT),OCTA检查中央凹无血管区(Area of the foveal avascular zone,FAZ)面积、黄斑区血管密度(Vessel density,VD)、微血管瘤(Microaneurysms,MAs)个数,并对DR患者进行中医分型研究。2.随机、单盲、前瞻性研究,收集2017.3-2019.3就诊于成都中医药大学附属医院眼科,明确诊断为具有临床意义的DME,中医辨证为阴阳两虚证患者65例,其中包括激光组25例(25眼),糖网化瘀合剂组19例(19眼),联合治疗组21例(21眼),所有患者均于基线和治疗后一个月、三个月、六个月采用国际标准视力表检查BCVA、OCT检查CMT、OCTA检查FAZ面积和黄斑区VD。同期收集具有临床意义的DME阴阳两虚证患者15例,连续服用糖网化瘀合剂15天,分别于服药前和服药后当天行热断层扫描(Thermal texture maps,TTM)检查,研究服药前后双侧眼部热值差值(△T)和头面部不同区位平均热值变化情况。3.体外研究,运用CCK-8、细胞计数法筛选抑制小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3 cells,NIH3T3)增殖的作用药物及作用浓度、作用时间;运用CCK-8、细胞计数、Edu染色法检测中药水蛭对NIH3T3细胞增殖的影响;TUNEL染色检测中药水蛭对NIH3T3细胞凋亡的影响;RT-PCR和Western blot检测中药水蛭对p38MAPK和caspase-3通路相关因子基因和蛋白相对表达影响。结果1.OCTA评估DME黄斑血流灌注(1).一般情况:所有受试者(平均年龄59.413±2.721岁),所有患者均为2型糖尿病(糖尿病病程8.8±0.57年;Hb A1c 7.744±1.241%)。(2).FAZ面积:DME组浅层毛细血管复合丛(Superficial vascular complex,SVC)FAZ面积为(0.55±0.11 mm~2),深层毛细血管复合丛(Deep vascular complex,DVC)FAZ面积为(0.61±0.26 mm~2)。与对照组和无DME的NPDR组相比,DME组SVC层FAZ面积扩大(p=0.000***,p=0.009**),DVC层FAZ面积扩大(p=0.000***,p=0.043*)。与SVC层相比,无DME的NPDR组DVC层FAZ面积扩大(p=0.041#);DME组和健康对照组DVC层FAZ面积无明显变化(p>0.05)。(3).黄斑区VD:DME组SVC层黄斑区VD为(46.88±5.41%),DVC层黄斑区VD为(45.75±6.42%)。与对照组和无DME的NPDR组相比,DME组SVC层黄斑区VD降低(p=0.001**,p=0.032*),DVC层黄斑区VD降低(p=0.000***,p=0.006**)。与SVC层相比,DME组和无DME的NPDR组DVC层黄斑区VD降低(p=0.019#,p=0.037#)。(4).MAs个数:DME组SVC层黄斑区MAs个数为(4.21±0.04个),DVC层黄斑区VD为(8.28±2.61个)。与对照组和无DME的NPDR组相比,DME组SVC层MAs个数增多(p=0.001**,p=0.012*),DME组DVC层MAs个数增多(p=0.000***,p=0.047*)。与SVC相比,DME组和无DME的NPDR组DVC层MAs个数增多(p=0.027#,p=0.001##)。(5).中医证型:DME组中阴阳两虚证(44.44%)患者所占比例最高(p=0.007**)。2.基于OCTA研究糖网化瘀合剂对阴阳两虚证糖尿病性黄斑水肿的黄斑区微血管影响(1).一般情况:所有患者均为2型糖尿病(平均年龄58.036±9.448岁;糖尿病病程8.782±0.582年;Hb A1c 6.918±0.857%)。(2).FAZ面积:糖网化瘀合剂组治疗后一月、治疗后三月、治疗后六月FAZ面积(mm~2)与基线相比,无明显改变(p=0.795,p=0.847,p=0.636);联合治疗组治疗后一月、治疗后三月、治疗后六月FAZ面积(mm~2)与基线相比,无明显改变(p=074,p=0.761,p=0.516)。(3).黄斑区VD:糖网化瘀合剂组治疗后一月、治疗后三月、治疗后六月黄斑区VD(%)与基线相比,无明显改变(p=0.335,p=0.184,p=0.276);联合治疗组治疗后一月、治疗后三月、治疗后六月黄斑区VD(%)与基线相比,无明显改变(p=814,p=0.177,p=0.509)。(4).BCVA:糖网化瘀合剂组治疗后一个月,BCVA较基线改善(p=0.037*),激光组和联合治疗组无明显改变(p=0.079,p=0.724);治疗后三个月和六个月,三组BCVA(Log MAR VA)较基线均改善(p<0.05)。(5).CMT:糖网化瘀合剂组治疗后一个月,CMT较基线下降(p=0.030*),激光组CMT较基线升高(p=0.042*),联合治疗组无明显改变(p=0.275);治疗后三个月和六个月,三组CMT较基线均降低(p<0.05)。(6).TTM:DME阴阳两虚证患者服用糖网化瘀合剂后双侧眼部热值差值(△T)下降(p=0.001**),前额、面部、头后上部的温度增加(p=0.031*,p=0.001**,p=0.047*)。3.中药水蛭抑制成纤维细胞增殖及分子机制研究(1).实验条件筛选:筛选0.006U/ml的中药水蛭作为干预药物及浓度,5天作为药物作用时间。(2).细胞增殖检测:0.006U/ml中药水蛭干预5天后,NIH3T3细胞数量减少(p=0.003**),吸光度下降(p=0.006**);Edu阳性细胞染色率降低(p=0.007**)。(3).细胞凋亡检测:0.006U/ml中药水蛭干预5天后,TUNEL阳性细胞染色率升高(p=0.004**)。(4).p38MAPK通路检测:0.006U/ml中药水蛭干预5天后,NIH3T3细胞TGF-β(p=0.030*)、TAK1(p=0.020*)、p38(p=0.000***)基因相对表达下降,TGF-β(p=0.003**)、TAK1(p=0.005**)、p38(p=0.000***)、p-p38(p=0.000***)蛋白相对表达下降。(5).caspase-3相关通路检测:0.006U/ml中药水蛭干预5天后,caspase-3基因相对表达上调(p=0.043*);caspase-3蛋白相对表达上调(p=0.000***)。结论1、基于OCTA结果显示DME患者黄斑区微血管结构改变,血流灌注降低。2、基于OCTA结果显示在观察期内糖网化瘀合剂可以维持阴阳两虚证糖尿病黄斑水肿患者的黄斑区微血管结构和血流灌注。3、中药水蛭能够抑制小鼠胚胎成纤维细胞增殖,其机制可能与抑制TGF-β/TAK1/p38MAPK通路活性有关,为中药水蛭进一步开发应用于抗PDR纤维化提供实验依据。