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西瓜是世界十大果品之一。我国西瓜的栽培面积及总产量均居世界之冠,占全世界的2/3强。因此我国堪称世界第一西瓜大国。虽然我国的西瓜产量已经有了很大的提高,已经满足了市场的需要,但是由于其生产科技含量不高,市场价值并没有得到很大的提高。因此,怎样提高西瓜的品质。尤其是营养品质已经成为西瓜育种工作者的首要任务。但是由于西瓜种质资源有限,运用常规育种方法周期较长等原因,其进展一直比较慢。随着生物技术的发展,利用外源基因来改变西瓜的遗传特性,选育出高品质的西瓜品种已经成为一种非常有潜力的方法。本研究以西瓜为研究材料首先构建了转基因植物表达载体,然后以西瓜子叶为外植体,建立了农杆菌介导的SAMDC基因转化体系,得到了转基因植株。本研究不仅为利用基因工程技术提高西瓜营养品质提供理论和技术依据,而且也为提高其他葫芦科蔬菜品种的营养品质开辟了一条新路。主要研究结果如下: (1) 构建了SAMDC基因植物表达载体。根据GenBank上发表的序列,设计两对引物。首先以酵母基因组DNA模板,克隆SAMDC基因;接着以番茄基因组DNA为模板,克隆E8启动子。然后把它们连接到双元载体pCAMBIAA1301上,构建了分别以CaMV35S和E8为启动子的表达载体。 (2) 优化了西瓜离体再生体系。通过不同的激素配比、外植体苗龄、外植体类型、光照条件等条件的筛选,提出了适合西瓜组织培养再生的最佳培养方案。子叶苗龄一般为4d最佳,分化率随着苗龄的增加而大大降低,子叶在黑暗条件下培养所获得的外植体分化率较高,外植体以子叶下端靠近胚轴的部分具有分化能力,其子叶上端分化能力很弱。其最佳的培养基配方为(MS+BAP 2mg·L-1+IAA 0.2mg·L-1+3%蔗糖+0.8%琼脂),其再生频率达平均达到65.3%。 (3) 建立了以西瓜子叶为外植体的遗传转化体系。以西瓜4d苗龄的子叶为转化外植体,研究外植体在不同的光照条件,不同的预培养时间(0d,1d,2d,3d),不同的菌液OD值(0,0.1,0.3,0.5,0.7)和不同的侵染时间(0min,5min,10min,15min),不同的共培养时间(0d,1d,2d,3d,4d)对转化效率的影响。另外也对抗生素对子叶分化的影响以及抑制农杆菌的效果也做了一定研究,发现使用15mg·L-1Hyg能够较好的筛选抗性芽,300mg·L-1的Cef能够在20天内抑制住农杆菌的大量繁殖。结果表明,外植体预培养2d,然后使用菌液侵染10min后转入含有(MS+BAP2mg·L-1+IAA0.2mg·L-1+AS 20mg·L-1+3%蔗糖+0.8%琼脂)的共培养培养基中黑暗条件下培养2天后,然后转接到(MS+BAP 2mg·L-1+IAA 0.2mg·L-1+Hyg 10mg·L-1+Cef 300mg·L-1+3%蔗糖+0.8%琼脂)的分化培养基中筛选抗性芽,培养条件为为白天温度28℃,晚上25℃,光周期为16h。半个月继代一次,即可得到部分抗性芽。 (4) 部分抗性芽经PCR检测,外源基因SAMDC已经转入到一些西瓜基因组DNA中。转基因植株的田间性状以及实品质性状正在观察。