论文部分内容阅读
黑色素是一种广泛存在于动植物以及微生物中由酚类化合物聚合而成的功能繁多的复杂多聚体,利用微生物所产天然黑色素可以在食品、化工产业和医疗制药等行业替代传统化学合成的黑色素产品。而酪氨酸酶是黑色素合成代谢途径中的关键酶,针对酪氨酸酶的研究,既奠定了微生物黑色素合成的调控基础,也对酪氨酸酶功能研究与开发具有重要意义。本文从大连星海湾海域筛选出一株产黑色素性状优良的菌株XH2,生理生化实验及16S rDNA鉴定XH2为一株假交替单胞菌(Pseudomonas sp),利用单因素试验对XH2产黑色素情况进行了优化。结果表明XH2在20℃,pH值为7,NaCl含量为1%g/L,L-Tyr含量0.5 g/L,CaCl2含量0.1 g/L时,产黑色素情况最佳,连续培养72 h,产黑色素量为1.164 g/L,相较于优化前其产量提高了2.6倍,并且测定了发酵液中酪氨酸酶活性,验证了酪氨酸酶的存在。从XH2基因组中克隆出了大小为580bp的酪氨酸酶基因序列,与pMD19-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,重组质粒经测序表明目的基因片段正向插入pMD19-T载体。生物信息学分析显示,目的基因序列长580 bp,编码了162个氨基酸,TYR基因拟表达蛋白的分子式C794H1249N203O236S6,分子量为17607.23Da,等电点大小为5.47,存在7个潜在的磷酸化位点,属于不稳定性的亲水性蛋白质,拟表达蛋白结构中不存在信号肽和跨膜结构域,其二级结构和三级结构显示主要以α螺旋和无规则卷曲结构为主。序列比对表明与已知酪氨酸酶序列有较高相似性。利用pET32a表达载体将目的基因转化到大肠杆菌BL21内,IPTG诱导的最佳浓度为1.0 mmol,以此浓度进行诱导表达目的蛋白,表达的融合蛋白分子量为17.6 kDa,在诱导3h时表达量最大。XH2的发现为微生物产黑色素提供了新研究对象,对其基因水平的研究,为微生物产天然黑色素进一步研发奠定了基础。