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动物模型是研究人类疾病、基因功能、诊断和治疗方法的重要工具之一。小型猪在新陈代谢、生理、解剖学结构和器官形态等方面比其它动物(如小鼠)与人类更相近,另外,猪的繁殖具有周期短,生育多的特点,能在一定时期内提供更多的实验材料。因此,利用小型猪制作人类疾病模型,开展药物研发,具有明显的优势和良好的发展前景。ENU(乙酰基亚硝基脲)是一种广泛使用的诱导突变剂,在斑马鱼和小鼠等模式生物的研究中应用广泛。ENU通过直接渗透到精原细胞而影响DNA的复制,从而诱导精子细胞基因组发生点突变。本研究通过注射不同浓度的ENU诱导大白及巴马公猪精子基因组发生点突变,诱变后与野生型母猪进行杂交获得F1代,30头诱变F1代大白猪及巴马公猪与野生型母猪交配获得诱变F2代母猪,F2代母猪再与其父本回交获得诱变F3代,在F3代群体中通过血常规及生化指标筛查代谢性疾病表型,建立大白及巴马猪隐性遗传家系,进而获得隐性纯合突变个体。共建立了 18个诱变大白猪家系,获得F3后代1236头;建立了 30个巴马家系,获得诱变F3代巴马猪1838头,通过对诱变F3代大白及巴马猪进行体重、体长和体高进行跟踪测量,结果表明诱变组和对照组在生长过程中体重、体长和体高变化趋势基本一致,个体间差异不显著(p>0.05)。对诱变F3代猪只进行血液生化指标分析,分别选出与对照组具有显著差异(P<0.05)指标的猪只47头与56头。在此基础上,本研究重点对F3代中潜在的代谢性疾病个体进行了筛查,发现出现包括高血脂、高胆固醇、心脏和血管等方面异常的个体。本研究在整个诱变群体上选择F3代24头1月龄巴马小型猪进行高脂日粮诱导试验,选择个体随机分为对照组与高脂诱导组,对照组饲喂普通饲料,高脂诱导组饲喂含2.0%胆固醇饲料,定时监测体重、血常规及生化指标,6个月后,进行心脏冠状动脉造影、各器官组织学检测及肝脏转录组分析。结果表明,高脂诱导组个体饲喂4月体重显著高于对照组,诱导期后血液生化指标中甘油三酯显著高于对照组,饲喂6个月时冠状动脉造影及各器官组织切片观察未见显著病变。进一步对肝脏组织进行转录组测序分析,结果显示高脂诱导组与对照组相比有2468个差异表达基因,主要与代谢途径相关。深入分析发现高脂诱导组中胰岛素信号通路相关基因表达出现抑制,其中IRS-2基因在高脂诱导组中显著低于对照组,预示着IRS-2在脂代谢中的关键作用。IRS-2是胰岛素信号通路中的重要信号底物,据此,本研究尝试阐述IRS-2基因在猪上的功能,进而明确IRS-2是否可以作为猪代谢疾病模型的靶基因。基于序列同源性,获得两段猪IRS-2基因片段(153bp和 427bp),进一步通过5’和3’RACE获得全长cDNA。该基因的cDNA全长为5816 bp,由5’非翻译区214 bp,编码区3276bp和2323 bp的3’非翻译区组成。采用实时定量PCR对各个组织中IRS-2mRNA的表达进行检测。结果显示,IRS-2在各组织中均有表达,大脑皮层、下丘脑、小脑表达量较高,在肝脏中IRS-2表达水平相对较高,而在空肠、肾脏、心脏和胰腺中低表达。与mRNA表达情况一致的是,IRS-2蛋白在大脑皮层、小脑和下丘脑中高表达;相反,在空肠、肾脏、心脏和胰腺几乎没有表达。免疫组织化学分析表明,IRS-2的定位局限在弓状核、腹内侧核、下丘脑的室旁核部,这些组织内也检测到散在的IRS-2分布。在大脑皮层,IRS-2也呈散在阳性染色。本研究在猪肝细胞及主动脉血管内皮细胞上进行了 IRS-2的功能研究。通过RNA干扰,评价了 IRS-2敲低后细胞相关功能基因的表达情况。在肝细胞中,IRS-2敲低导致PEPCK、SREBP-1和LXR mRNA的表达水平显著增高,对Fbp-1表达没有明显影响,而GCK mRNA的表达显著下降。本研究进一步检测LXR下游胆固醇代谢相关基因的表达,结果表明,ABCG8、CYP7A1表达水平在IRS-2敲低细胞中显著上升。在主动脉血管内皮细胞中本研究评价了 HO-1、VEGFA、VCAM-1、GLUT-1、和GLUT-2在IRS-2敲低后的变化。结果显示:eNOS与HO-1的mRNA的表达水平明显降低,而VCAM-1 mRNA表达明显增加。VEGFA、GLUT-1和GLUT-2 mRNA在IRS-2敲低后表达无明显变化。以上这些结果暗示IRS-2在肝脏及血管内皮中是胰岛素信号通路的重要底物基因,同时也是糖脂代谢通路中重要的上游信号分子,对于维持机体糖脂代谢稳态是必须的。进一步,本研究利用CRISPR-Cas9基因编辑系统构建了 IRS-2基因敲除猪胎儿成纤维细胞,并获得了 IRS-2敲除核移植胚胎,为接下来获得IRS-2基因敲除疾病模型猪奠定基础。综上所述,本研究得到结论如下:1、通过ENU诱变成功获得了代谢异常F3代个体;2、成功克隆了猪IRS-2的完整cDNA序列,确定了猪IRS-2在不同组织中的表达模式;3、明确了 IRS-2敲低会导致猪肝细胞和动脉内皮细胞功能异常。这些结果将有助于通过靶向IRS-2建立糖尿病和血管相关猪代谢性疾病模型。