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黄瓜(Cucumis sativus L.)是葫芦科重要的蔬菜作物,其性别表现复杂多样,是研究植物性别决定和性别分化的良好实验材料。雌花发生的早晚及其分布状态,即性型表现,与黄瓜成熟早晚、产量和品质等有密切的关系。目前全雌性或强雌性是黄瓜优势育种的重要途径。但由于黄瓜性别表现受到遗传和环境等多种因素的影响,应用传统方法从表型上进行全雌性基因的选择效率不高。近年来,黄瓜的分子标记辅助育种技术日益受到研究人员的关注。它可以弥补传统育种方法的不足,提高其准确性,加速育种进程。开展DNA分子标记研究是进行黄瓜分子标记辅助选择育种、分离和克隆基因的基础。遗传学分析表明,黄瓜的性别表型受3类基因F、m、a的控制,其中F基因控制雌性表达。在几类植物激素中,生长素、乙烯可强化植物的雌性表达,植株茎端乙烯的形成与雌花的分化存在很大相关性。由于ACC合酶是乙烯生物合成过程中的关键酶,因而ACC合酶在高等植物性别表达过程中的作用已受到人们的关注。许多研究者认为ACC合酶基因与控制黄瓜雌性的F位点存在紧密连锁关系。本文利用RAPD技术,筛选与黄瓜全雌性状相关的分子标记,同时将RAPD标记转换为特异性和稳定性好的SCAR标记,为实现黄瓜的早期性别鉴定与全雌性状的分子辅助育种提供依据。另外,通过对ACC合酶基因的克隆和测序,试图找到黄瓜不同品系中ACC合酶基因的差异,比较其与黄瓜不同性别表达类型的关系,探讨该基因在黄瓜性别决定过程中的作用。结果报告如下:(1) CTAB法提取黄瓜核基因组总DNA,采用RAPD技术对39条随机引物进行初步筛选,其中有12条引物显示多态性,以此作为筛选全雌性特异的分子标记的候选引物。(2)对多态性引物进一步筛选,引物S10和S435可以在全雌系黄瓜中扩增出两条稳定、清晰的特异条带,大小约2000bp和500bp,分别记作S10-2kb和S435-0.5kb,而对照单株(雌雄同株)中不存在。可见,这两个分子标记具有性型特异性。(3)对S10-2kb和S435-0.5kb两个特异分子标记进行回收、克隆并测序,获得全长DNA序列,大小分别为2003bp和470bp。经BLAST分析,发现S10-2kb分子标记与数据库中已知的黄瓜序列同源性低,该片段可能为黄瓜中新发现的DNA序列;对S435-0.5kb序列而言,所有的同源序列均与葫芦科植物无关,该标记系黄瓜中新发现的DNA序列。两个分子标记已提交GenBank注册,序列号分别是EF 057801和EF 062502。ORF Finder分析表明,S10-2kb序列含有最长能编码62个氨基酸的开放读框;而S435-0.5kb序列,其最长的ORF编码68个氨基酸。以上两个分子标记编码短肽的生理功能尚不确定,其生物学意义有待进一步研究。(4)依据2003bp序列设计两对特异引物(CS1和CS2),将RAPD标记转化为SCAR标记。扩增结果显示,引物CS1在转化过程中失去了多态性,而CS2能够在全雌品系黄瓜中扩增出目的条带,雌雄同株黄瓜中却不出现,表明成功转化为SCAR标记,可作为黄瓜苗期性别鉴定的一对特异引物。(5)根据已发表的ACC合酶基因序列,设计一对专一性引物,以全雌、强雌和弱雌性黄瓜品系为材料进行PCR扩增。在全雌和强雌品系中获得预期大小的DNA片段,而弱雌品系则不存在。经克隆和测序分析,获得全长1042bp的序列,比前人报道的序列长1bp,而最长ORF编码的氨基酸序列则完全一致;经BLASTn检索,发现与黄瓜CS-ACS1、CS-ACS1G基因同源性最高(同源性为85%左右),初步推断该片段为ACC合酶基因(ACSG)。鉴于ACSG与雌性系表型之间存在一定的相关关系,ACSG基因可能是鉴定黄瓜雌性系的一个分子标记。另外,可以检索到与葫芦科其他作物和蔷薇科ACC合酶基因有较高同源性,与十字花科、豆科、茄科等植物的ACC合酶基因具有低度的同源性。结论:RAPD技术用于寻找黄瓜全雌性状相关的分子标记是可行的,在RAPD的基础上将其转化为SCAR标记可提高MAS的准确性和效率。本文获得的一对SCAR特异引物CS2,可用于黄瓜苗期性别鉴定;ACC合酶基因存在于全雌系和强雌系黄瓜中,为雌性系特有。通过克隆获得了全雌性黄瓜中的ACC合酶基因序列(ACSG)。鉴于ACSG与雌性系表型之间存在一定的相关关系,认为ACSG基因可能是鉴定黄瓜雌性系的一个分子标记。