肺癌是全世界最常见的高致死性癌症之一,其中非小细胞肺癌超过8成,包括鳞癌、腺癌和大细胞癌。非小细胞肺癌因其低增殖速率和低迁移能力导致超过7成的患者发现时已处于中晚期,因此生存率也很低。化疗作为治疗非小细胞肺癌的主要手段之一,仅能在早期患者治疗中有效地发挥作用,即使通过多药联用也只能达到约30%的有效率,因此化疗常作为辅助手段协助外科治疗、免疫治疗、靶向治疗和放射治疗。本课题统计发现RuvBL1在肺癌患者样本中高表达,并且其高表达表现出不良的临床行为和较差的生存率,因此推测RuvBL1可能影响了非小细胞肺癌细胞对化疗药物的敏感性。RuvBL1是AAA+超家族蛋白成员之一,具有ATP酶和解旋酶活性,能与多种蛋白发生相互作用,形成具有转录调控活性的蛋白复合物,参与转录调控、染色质重组、DNA损伤修复等多个细胞事件。近年来的研究表明,RuvBL1在肝癌、结肠癌、淋巴癌等多种肿瘤细胞中表达水平显著提高,并且可与Myc、β-catenin等多种致癌因子相互作用影响肿瘤的发生发展。目前围绕RuvBL1致癌性的研究很多,但是RuvBL1与癌症患者的预后相关性一直没有受到关注。在肺癌患者样本中,通过Kaplan对TCGATM数据库进行分析发现RuvBL1表达水平与预后具有相关性,生存曲线表明高表达RuvBL1的患者预后生存时间更短。接着发现高表达RuvBL1的肺癌细胞株对抗肿瘤药物TRAIL诱导的细胞凋亡表现出低敏感性。因此,本课题以RuvBL1参与肺癌细胞的抗凋亡功能为切入点,从新的角度来探索RuvBL1在肺癌发生发展及抗凋亡治疗中的作用。首先在肺癌细胞中证实了RuvBL1具有抗凋亡功能。肺癌细胞系中内源性高表达RuvBL1表现出对TRAIL诱导凋亡的低敏感性,在肺癌细胞A549中外源性过表达RuvBL1则能够显著地抑制TRAIL诱导的细胞凋亡。期间,在RuvBL1抗TRAIL诱导细胞凋亡的实验中同时检测到c-Jun表达水平的下降,因此推测c-Jun参与了RuvBL1的抗凋亡作用。c-Jun是AP-1蛋白家族成员,通过调控靶基因的转录激活参与细胞凋亡。在TRAIL诱导肺癌细胞凋亡的过程中,JNK通路被激活,c-Jun作为JNK的靶蛋白被磷酸化,继而激活AP-1转录复合物,启动细胞凋亡相关蛋白的转录激活。于是借助细胞转染的过表达体系和干扰体系,通过流式细胞术和Western Blot检测验证了c-Jun参与TRAIL诱导的细胞凋亡,并发挥促凋亡功能。接着开展了RuvBL1与c-Jun表达相关性的探究。随着细胞内RuvBL1表达水平的升高,c-Jun的表达水平降低,并表现为剂量依赖型的负调控关系。当共表达RuvBL1与c-Jun时,RuvBL1不能显著下调c-Jun的表达,并因此失去了抑凋亡功能。因此得出结论,RuvBL1通过调控c-Jun的表达发挥抗凋亡功能。最后,围绕RuvBL1调控c-Jun表达的分子机制展开研究。首先,在蛋白水平上进行验证,采用CHX处理细胞后发现RuvBL1的表达并没有影响c-Jun的蛋白质降解,说明RuvBL1对c-Jun蛋白水平的调控与蛋白降解途径无关。接着,采用AP-1-Luc报告基因进行转录活性的检测,荧光素酶活性测定表明RuvBL1能抑制c-Jun/AP-1的转录活性。转录活性通常由两方面因素调控:一是转录因子的磷酸化激活,二是转录因子的DNA结合能力。Western Blot结果表明RuvBL1不影响c-Jun的磷酸化激活,而EMSA实验证实RuvBL1抑制了c-Jun的DNA结合能力。c-Jun是AP-1转录复合物的主要成分,其自身也是AP-1的下游靶基因。进一步通过Ch-IP实验发现,RuvBL1抑制了c-Jun与c-jun promoter的结合,从而抑制了c-Jun的转录,表现为对c-Jun表达水平的负调控。本课题以RuvBL1在肺癌中高表达和预后相关性为出发点,研究发现了RuvBL1具有抗凋亡功能,并阐明了其抗凋亡的分子机制,为肺癌治疗提供了新的参考依据和理论指导。对非小细胞肺癌对化疗药物的低敏感性作出了可能的解释,为肺癌治疗手段的发展和预后生存时间的延长提供了新的切入点。