丛枝菌根（Arbuscular mycorrhiza,AM）是植物根部与隶属球囊菌亚门（Glomeromycotina）的真菌之间形成的一种互相交换营养的共生体。AM的起源非常古老,演化至今已成为绝大多数植物保障营养供给,并增强自身抗逆性的一种不可或缺的生活方式。在过去的18年里,研究人员从不同植物中一共鉴定出了60余个AM共生调控基因,分别涉及共生信号分子的合成、识别与传导、膜融合与物质运输、以及营养交换等多个方面。目前,AM的研究仍有许多空白,更多的调控基因尚未被有效鉴定。最近,研究人员开始利用基因家族演化分析的方法来筛选符合“共生演化模式”的基因,即通过比较共生植物与非共生植物（丧失AM共生能力）的基因组数据,从中寻找那些在共生植物中一直稳定遗传、但在非共生植物中却已丢失的直系同源基因。本实验室前期收集的水稻转录组数据表明,至少有413个水稻基因的表达水平在AM共生过程中显著上调。从这一研究基础出发,本研究从中选取了50个上调八倍以上的候选基因,进而利用13个陆地植物的基因组数据对每个候选基因进行同源基因搜索,开展细致的基因家族演化分析,结果筛选出七个符合“共生演化模式”、前人尚未报道过的新基因。其中,基因Os HGSNAT编码一个类肝素N乙酰葡糖胺转移酶;基因Os DUF588编码一个含有未知功能结构域DUF588（可能与膜相关）的蛋白;Os DUF538-a和Os DUF538-b为水稻同一分支近期复制的两个基因,它们编码的蛋白均含有未知功能的DUF538结构域;基因Os CBP编码一个柠檬酸盐结合蛋白的前体;基因Os MACPF编码一种与防御相关的膜穿孔蛋白;而基因Os ACT编码一个含有ACT结构域的蛋白。我们进而针对这七个水稻AM共生候选基因,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行针对性敲除。每个基因均设计两个先导RNA（guide RNA,g RNA）,以期对两个不同编码区位置进行特异性编辑。对水稻T0阳性苗的鉴定结果表明:14个g RNA均成功发挥作用,编辑效率达60%-90%,七个候选基因均敲除成功且得到多种编辑类型。经过选择繁种,每个基因成功获得两个以上T1代纯合突变株系。最后,将这些基因的T1代突变体与野生型水稻日本晴同时与AM真菌Rhizophagus irregularis建立共生,五周后观察比较侵染表型。结果发现:在Oshgsnat突变体中,根内菌丝的定植率及形成的丛枝细胞丰度均显著降低;Q-PCR数据也证实突变体中两个AM共生标记基因（早期表达基因AM1与后期表达基因PT11）连同Os HGSNAT基因自身的表达量均显著降低,说明Os HGSNAT基因是AM正常发育所必需的。基因Os DUF588突变后,虽然根内菌丝的定植率未受影响,但丛枝细胞丰度却显著降低,囊泡数量有所增加;同时PT11的表达量也在两个突变系中显著下调,推测该基因的缺失可能导致营养交换异常,从而加速了丛枝的衰老消退。基因Os DUF538-a与Os DUF538-b为同一分支的两个拷贝,其中Osduf538-b突变体的真菌定植率有所降低,而Osduf538-a突变体表型与野生型相比未见显著差异,推测两个基因间存在部分功能冗余,且Os DUF538-b更可能发挥重要作用。Oscbp与Osmacpf突变体与AM真菌建立共生后,其根部真菌定植率与野生型相比均显著降低,同时突变体植株的地上部也比对照更加矮小,其背后可能影响水稻生长发育的机制值得进一步研究。最后一个基因Os ACT突变之后,真菌定植率和丛枝丰度均未发现明显变化。综上所述,本研究以水稻转录组数据为基础,通过基因家族演化分析,从中筛选出七个符合共生演化模式的AM共生上调表达基因进行了针对性研究,所开展的基因敲除工作与表型鉴定结果,为后续深入研究这些基因调控AM共生、甚至影响水稻生长发育的分子及生理机制奠定了重要基础。