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目的：
了解我院儿童腹泻标本中轮状病毒(Rotavirus，RV)分离株G血清型和P基因型的流行特点，并对RV的三种检测方法：胶体金法、RT-PCR法和PAGE法进行方法学的比较；应用分子生物学技术，将编码轮状病毒NSP4蛋白86-175位氨基酸的基因片段克隆入PGEX-4T-1载体，为后续蛋白表达奠定基础。
方法：
1．收集2007年5月～2010年4月因腹泻症状就诊儿童的资料及粪便标本9980份，经胶体金法筛检A群轮状病毒抗原阳性标本，对其送检来源及各科室的RV-AG阳性检出率进行统计分析；留取其中2009年11月～2010年4月轮状病毒抗原阳性、≤5岁住院腹泻患儿标本153份，采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，巢式-聚合酶链反应(Nest-PCR)法，对VP7、VP4基因分型。
2．收集2009年11月～2009年12月腹泻患儿送检标本，分别进行胶体金法、RT-PCR法和PAGE法检测RV-AG，计算各种方法的阳性检出率，用SPSS软件进行x2分割法分析。计算特异度、灵敏度、正确率和Youden指数(YI)来评价三种检测方法的准确度。
3．随机抽取G血清型和P基因型分型结果为G3P[8]型RNA样本5份，采用RT-PCR扩增NSP4基因全长并测序，BLAST比对后，Nest-PCR扩增编码NSP4蛋白第86-175位氨基酸的基因，经纯化回收后，将其克隆入pMD18-Tsimplevector中构建重组质粒pMD18-T-NSP486-175，并用BamHI和SalI双酶切该重组质粒并测序，纯化并回收酶切后得到的288bp片段，将其克隆至原核表达载体PGEX-4T-1的BamHI/SalⅠ位点，构建重组质粒PGEX-4T-1-NSP486-175，转化感受态受体菌E.coliDH5α，，用双酶切鉴定并测序。
结果：
1.2007年5月～2010年4月期间，胶体金法检测儿童腹泻粪便标本9980例，RV-AG阳性标本3544例，其阳性率为35.51％；男孩RV-AG检出率为25.44％(590/2319)，女孩RV-AG检出率为26.12％(279/1068)，性别检出率差异无统计学意义(x2=0.178，P=0.673)，各月龄组检出率以6-12月龄组最高，达30.44％；门急诊和住院患儿RV-AG检出率分别为32.02％(357/1115)和35.95％％(3187/8865)，差异有统计学意义；对送检来源进行统计发现，送检标本大多数来自A07儿内消化病区(25％，2451/9980)，B03儿童综合病区(17％，1727/9980)和A03儿童感染病区(12％，1227/9980)，除A09儿内肾病病区、D19新生儿ICU和D20新生儿病区外，其余科室三年间RV-AG阳性检出率均无明显变化，D20于2010年4月27～30日出现RV院感爆发流行。
2．留取的2009年11月～2010年4月轮状病毒抗原阳性、55岁住院腹泻患儿153份标本中，G3型79份(51.63％)，G1型40份(26.14％)，G1G3型20份(13.07％)，G2G3型3份(1.96％)，G未分型11份(7.19％)：P[8]型104份(67.97％)，P[4]型3份(1.96％)，P[8]P[4]型1份(0.65％)，P未分型45份(29.41％)，G血清型和P基因型的组合以G3P[8]为主，占33.33％(51/153)。
3.2009年11月～2009年12月共收集腹泻患儿送检标本129份，分别经胶体金法、RT-PCR法和PAGE法检测，阳性率分别为24.80％(32/129)，11.63％(15/129)，26.36％(34/129)，经x2分割法，按α＇=0.0125水准，PAGE法和胶体金法、RT-PCR法的检出率均有差别，而胶体金法和RT-PCR法检出率无显著差异。以PAGE法为检测轮状病毒的最终标准，计算胶体金法和RT-PCR法的灵敏度为93.33％和100％、特异度为84.21％和83.33％、正确率同为85.27％，以及YI为0.7754和0.8333，说明RT-PCR法的准确度更高。
4．RT-PCR法扩增出770bp的NSP4全长基因，测序并BLAST比对后与Nov08-3404株同源性达99％，Nest-PCR扩增编码NSP4蛋白第86-175位氨基酸的基因得到大小为288bp片段，经纯化回收后，将其克隆入pMD18-Tsimplevector中构建重组质粒pMD18-T-NSP486-175，并用BamHI和SalⅠ双酶切该重组质粒并测序，结果显示无突变。重组质粒PGEX-4T-1-NSP486-175经BamHI和SalⅠ双酶切并测序，酶切后电泳显示分别在300bp左右和5000bp左右出现明显条带，表明PGEX-4T-1-NSP486-175原核表达构建成功。
结论：
我院A群轮状病毒以G3型为主，其次为G1型，P基因型以P[8]型为主，未检测出其他型别，发病年龄以6～12月龄组最高。对胶体金、RT-PCR和PAGE法进行了方法学比较，三者检出率有显著差异，胶体金、RT-PCR法检出率无显著差异，二者均优于PAGE法。PCR成功构建PGEX-4T-1-NSP486-175，为进一步NSP4蛋白表达及研究NSP4蛋白在细胞内的作用奠定基础。