论文部分内容阅读
目的:
了解我院儿童腹泻标本中轮状病毒(Rotavirus,RV)分离株G血清型和P基因型的流行特点,并对RV的三种检测方法:胶体金法、RT-PCR法和PAGE法进行方法学的比较;应用分子生物学技术,将编码轮状病毒NSP4蛋白86-175位氨基酸的基因片段克隆入PGEX-4T-1载体,为后续蛋白表达奠定基础。
方法:
1.收集2007年5月~2010年4月因腹泻症状就诊儿童的资料及粪便标本9980份,经胶体金法筛检A群轮状病毒抗原阳性标本,对其送检来源及各科室的RV-AG阳性检出率进行统计分析;留取其中2009年11月~2010年4月轮状病毒抗原阳性、≤5岁住院腹泻患儿标本153份,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),巢式-聚合酶链反应(Nest-PCR)法,对VP7、VP4基因分型。
2.收集2009年11月~2009年12月腹泻患儿送检标本,分别进行胶体金法、RT-PCR法和PAGE法检测RV-AG,计算各种方法的阳性检出率,用SPSS软件进行x2分割法分析。计算特异度、灵敏度、正确率和Youden指数(YI)来评价三种检测方法的准确度。
3.随机抽取G血清型和P基因型分型结果为G3P[8]型RNA样本5份,采用RT-PCR扩增NSP4基因全长并测序,BLAST比对后,Nest-PCR扩增编码NSP4蛋白第86-175位氨基酸的基因,经纯化回收后,将其克隆入pMD18-Tsimplevector中构建重组质粒pMD18-T-NSP486-175,并用BamHI和SalI双酶切该重组质粒并测序,纯化并回收酶切后得到的288bp片段,将其克隆至原核表达载体PGEX-4T-1的BamHI/SalⅠ位点,构建重组质粒PGEX-4T-1-NSP486-175,转化感受态受体菌E.coliDH5α,,用双酶切鉴定并测序。
结果:
1.2007年5月~2010年4月期间,胶体金法检测儿童腹泻粪便标本9980例,RV-AG阳性标本3544例,其阳性率为35.51%;男孩RV-AG检出率为25.44%(590/2319),女孩RV-AG检出率为26.12%(279/1068),性别检出率差异无统计学意义(x2=0.178,P=0.673),各月龄组检出率以6-12月龄组最高,达30.44%;门急诊和住院患儿RV-AG检出率分别为32.02%(357/1115)和35.95%%(3187/8865),差异有统计学意义;对送检来源进行统计发现,送检标本大多数来自A07儿内消化病区(25%,2451/9980),B03儿童综合病区(17%,1727/9980)和A03儿童感染病区(12%,1227/9980),除A09儿内肾病病区、D19新生儿ICU和D20新生儿病区外,其余科室三年间RV-AG阳性检出率均无明显变化,D20于2010年4月27~30日出现RV院感爆发流行。
2.留取的2009年11月~2010年4月轮状病毒抗原阳性、55岁住院腹泻患儿153份标本中,G3型79份(51.63%),G1型40份(26.14%),G1G3型20份(13.07%),G2G3型3份(1.96%),G未分型11份(7.19%):P[8]型104份(67.97%),P[4]型3份(1.96%),P[8]P[4]型1份(0.65%),P未分型45份(29.41%),G血清型和P基因型的组合以G3P[8]为主,占33.33%(51/153)。
3.2009年11月~2009年12月共收集腹泻患儿送检标本129份,分别经胶体金法、RT-PCR法和PAGE法检测,阳性率分别为24.80%(32/129),11.63%(15/129),26.36%(34/129),经x2分割法,按α'=0.0125水准,PAGE法和胶体金法、RT-PCR法的检出率均有差别,而胶体金法和RT-PCR法检出率无显著差异。以PAGE法为检测轮状病毒的最终标准,计算胶体金法和RT-PCR法的灵敏度为93.33%和100%、特异度为84.21%和83.33%、正确率同为85.27%,以及YI为0.7754和0.8333,说明RT-PCR法的准确度更高。
4.RT-PCR法扩增出770bp的NSP4全长基因,测序并BLAST比对后与Nov08-3404株同源性达99%,Nest-PCR扩增编码NSP4蛋白第86-175位氨基酸的基因得到大小为288bp片段,经纯化回收后,将其克隆入pMD18-Tsimplevector中构建重组质粒pMD18-T-NSP486-175,并用BamHI和SalⅠ双酶切该重组质粒并测序,结果显示无突变。重组质粒PGEX-4T-1-NSP486-175经BamHI和SalⅠ双酶切并测序,酶切后电泳显示分别在300bp左右和5000bp左右出现明显条带,表明PGEX-4T-1-NSP486-175原核表达构建成功。
结论:
我院A群轮状病毒以G3型为主,其次为G1型,P基因型以P[8]型为主,未检测出其他型别,发病年龄以6~12月龄组最高。对胶体金、RT-PCR和PAGE法进行了方法学比较,三者检出率有显著差异,胶体金、RT-PCR法检出率无显著差异,二者均优于PAGE法。PCR成功构建PGEX-4T-1-NSP486-175,为进一步NSP4蛋白表达及研究NSP4蛋白在细胞内的作用奠定基础。