胫骨软骨发育不良(Tibial dyschondroplasia,TD)是一种家禽的营养代谢性腿部疾病,主要在胫骨干骺端的肥大软骨细胞区出现非血管化和非钙化的不成熟的软骨细胞堆积在生长板,表现为软骨内骨化的异常。在1965年,该病最先在美国被Leach RM和MC Nesheim在青年肉鸡上发现并报道,随后在火鸡和鸭等家禽上也陆续发现,临床主要表现为不愿站立,腿部骨骼变形,行动缓慢并常常以双翅来辅助行走,严重者丧失行走能力,影响采食。禽类TD病在世界各国呈广泛分布,没有区域集中性或特意高发性,每年给全世界禽类行业造成不可估量的经济损失。由于发病原因的复杂性,增加了研究其机理的难度性,肉鸡发生TD的最根本的病因至今还不清楚。藏鸡(Tibetan chicken,TBC)主要生活在海拔2,200~4,100 m的青藏高原农牧地区,是世界上在高海拔低氧环境生活历史最悠久的土著鸡种,且至今未见有藏鸡腿病的报道,这可能与其长期生活在高海拔低氧环境有关。研究指出肉鸡TD的发生与胫骨生长板血管生成的异常有关,而骨骼的形成过程都与血管生长的过程是紧密相关的。鉴于此,我们对高海拔藏鸡和低海拔肉鸡进行了对比研究,并验证高海拔低氧环境对低海拔肉鸡的胫骨生长发育的影响,也对肉鸡TD的发生是否与胫骨生长板血管生长抑制有关作进一步研究,同时更深入的研究肉鸡发生TD时,胫骨生长板血管生长过程是如何调控的以及血管生成的减少如何影响胫骨的生长和发育。主要研究内容如下:1.藏鸡与肉鸡在生产性能和骨骼发育上的对比研究与生活在低海拔肉鸡相比,藏鸡在骨骼生长方面是否存在什么特殊之处至今仍很大的未知。在同一月份内,120只1日龄健康高海拔TBC和低海拔爱拔益加肉鸡(Arbor Acres chicken,AAC)分别在两地进行饲养。结果显示:TBC的采食量、日增重和体重,以及胫骨的重量、胫骨的长度和胫骨生长板的宽度均显著低于低海拔AAC(p<0.05)。然而,胫骨的组织病理观察到藏鸡胫骨生长板区域血管的分布明显增多。q RT-PCR结果显示HIF-1ɑ、VEGFA以及其受体VEGFR1和VEGFR2在藏鸡胫骨生长板上的表达量均显著高于低海拔AAC(p<0.05)。ELISA结果也显示类似的改变,整个试验期间藏鸡血清VEGFA的蛋白含量均高于低海拔AAC。血清中 VEGFR2和IL-8蛋白含量除了第7天低于AAC,在第3天、第10天和第14天均显著高于AAC(p>0.05)。这些结果表明,高海拔缺氧环境对TBC的身体和胫骨的生长是抑制的。但藏鸡胫骨生长板区域分布丰富的血管,而且较高血管生成调控基因HIF-1ɑ、VEGFA以及其受体的表达,这可能就是TBC不发生TD的原因。2.高海拔低氧环境对肉鸡胫骨生长板上HIF-1α/VEGF/VEGFR信号通路表达的影响藏鸡是青藏高原上一个土著的地方鸡种,能够对当地严酷的高原低氧含量、低气压、高寒的环境有很好的适应性。并且通过之前的研究发现藏鸡胫骨生长板区域拥有更丰富的血管分布,血管生长相关调控基因表达水平也较高。那么,高海拔低氧环境是否可以诱导胫骨生长板更多的血管分布还未深入研究。因此,本实验选取120只健康低海拔AAC,运输到高海拔地区西藏进行饲养,分为自然低氧组和正常氧气组进行试验。结果显示,在高海拔低氧环境下AAC的生产性能和体重都受到抑制,死亡率增加;另外,胫骨的重量和长度也不同程度受到抑制。然而,血液常规指标显示在低氧环境下AAC在第14天出现的红细胞(RBC)、血红蛋白(Hb)和红细胞压积(Hct)增加。值得注意的是,胫骨的组织病理学分析显示在自然低氧环境14天后AAC胫骨生长板区域血管密度显著增加。q RT-PCR和Western blot结果显示肉鸡在高海拔低氧的条件下,胫骨生长板上缺氧应激基因HIF-1ɑ和血管生长相关基因VEGFA和VEGFR1的表达水平都有显著的过表达。ELISA检测血清蛋白含量进一步证实缺氧条件下可以增加血清中VEGFA、VEGFR2和IL-8的蛋白含量。这些结果说明,低海拔AAC生活在高海拔低氧环境下,可以通过调控机体缺氧应激基因HIF-1ɑ和血管生长相关基因VEGFA和它的受体的表达,促进胫骨生长板肥大软骨细胞区血管分布的增加。3.HIF-1ɑ/VEGF/VEGFR信号通路在福美双诱导的TD肉鸡上的作用机制TD是一种比较棘手的家禽腿病问题,组织病理显示在胫骨近端的生长板上出现大面积的非血管化和非钙化的“软骨楔”为特征,导致骨骼钙化不全,这可能与胫骨生长板血管生成异常有关。然而,血管生成抑制在肉鸡TD发生中所扮演的角色仍然还不清楚。通过福美双诱导肉鸡发生TD期间观察到肉鸡发生跛行,胫骨生长板增宽,呈白色的非血管区。对胫骨形态指标测量显示胫骨的重量和长度减少,生长板宽度及生长板宽度系数增加。组织病理显示AAC发生TD时,胫骨近端静止区和增殖区血管的分布没有显著改变,而肥大软骨细胞区血管的分布呈显著的减少并且软骨细胞大量死亡。另外,血常规指标也显示AAC发生TD时,RBC、Hb和Hct都显著减少。接下来通过q RT-PCR、Western blot和ELISA的方法分别检测胫骨生长板上和肉鸡血清中血管生成相关基因和蛋白的表达情况,结果显示:HIF-1ɑ、VEGFA以及它的受体的基因表达和蛋白水平在第7天TD肉鸡组都显著的减少,并且这些基因的表达水平与胫骨生长板血管的分布呈极强的正相关。总之,这些发现说明AAC发生TD时,机体可能是通过下调胫骨生长板上血管生成相关基因和蛋白HIF-1ɑ、VEGFA以及它的受体的表达,从而抑制胫骨肥大软骨细胞区血管的分布,导致家禽胫骨生长发育的抑制。4.VEGF/FGF/Ang-1/PDGF-BB及其受体在TD肉鸡胫骨血管形成过程中的作用机制先前的研究表明,骨骼是一种高度血管化的组织,并且依赖于血管生成与成骨形成之间的协调耦联。既然血管生成的抑制和肉鸡TD的发生具有极大的相关性,那么肉鸡TD发生时,胫骨生长板肥大区血管形成过程是如何被调控的仍不清楚。研究结果显示:AAC发生TD时,中胚层分化的标志性基因纤维母细胞生长因子2(FGF2)和受体FGFR1表达水平下降;血管岛形成标志性基因血管内皮生长因子(VEGF)和受体VEGFR1VEGR2的血清蛋白浓度被显著降低;血管岛成熟相关基因的调控包括血管生成素(Ang1,Ang2)以及它们的内皮受体酪氨酸激酶Tie2等相关基因被抑制,这些或许将导致血管发生的推迟。另外,机体通过下调VEGFA和VEGFR1VEGFR2受体基因和蛋白的表达,上调血小板源性生长因子(PDGF)-BB及受体PDGFR-β基因表达和血清蛋白水平的升高,导致胫骨生长板血管的异常增殖和成熟,血管生成的减少。总之,肉鸡发生TD时,血管生成的抑制可能是通过抑制血管发生和血管生成过程的相关调控基因和蛋白的表达,从而导致胫骨生长板上血管分布的减少。5.OPG/RANKL信号通路在TD肉鸡胫骨生长上的作用机制TD肉鸡血管形成的抑制势必会影响骨的正常形成,那么骨生成过程发生怎样的异常调控至今仍不清楚。研究结果显示:与正常组AAC相比,肉鸡发生TD时,肉鸡的体重,胫骨的骨量、长度和中央直径都显著减少,并且体重与胫骨的骨量呈正相关。组织病理和形态学结果显示TD肉鸡胫骨近端生长板肥大区血管分布显著减少,软骨细胞呈核固缩和核溶解,生长板宽度增加。血清生化结果显示AAC发生TD时血清碱性磷酸酶(ALP)活性受到抑制,钙磷平衡被破坏。另外,通过q RT-PCR和ELISA检测胫骨生长板和血清中调控骨骼生成相关基因和蛋白发现TD肉鸡胫骨生长板和血清中骨保护素(OPG)基因和蛋白的表达都显著受到抑制,核因子κB受体活化因子配体(RANKL)表达水平上调,这将促进其受体核因子-κB受体活化因子(RNAK)信号的激活。并且OPG的水平与胫骨生长板上血管的分布以及胫骨的生长呈正相关,RANKL呈负相关。这些结果说明肉鸡TD发生时,胫骨近端血管浸入的减少导致软骨细胞的死亡影响骨架的延伸,同时死亡软骨细胞在生长板肥大软骨细胞的堆积,在生长板处形成严重的损伤区域。另外,肥大软骨细胞区血管侵入的减少,血清钙磷水平的失调影响肥大区软骨基质的钙化。基因水平进一步说明,促进骨形成的OPG基因被抑制,而RNAKL基因的上调,促进RNAK信号激活破骨细胞的骨吸收功能,从而影响骨的转化,导致骨量的减少。总之,试验通过对藏鸡的研究首次揭示藏鸡不发生胫骨软骨发育不良的生理机制可能是通过长期的高海拔低氧环境适应,上调HIF-1ɑ,VEGF以及其受体基因的表达,提高胫骨生长板上血管的侵入有关;而且,高海拔缺氧环境对肉鸡的影响进一步证实这一作用机制。另外,福美双诱导的肉鸡TD模型显示胫骨生长板上VEGF以及其受体VEGFR1和VEGFR2基因的异常表达,抑制胫骨生长板血管化与肉鸡TD发生存在极强的正相关,这一过程可能是通过血管发生与血管生成过程中相关调控基因的异常表达,从而抑制胫骨血管化的正常分布而实现的;重要的是,血管与骨的形成是紧密相偶联的,胫骨血管化的减少影响OPG/RANKL信号通路的不平衡的表达,血清中钙磷比的异常,最终影响骨的形成,引起胫骨骨量的减少。