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目的:宫颈癌是女性最常见癌症之一,是导致全球女性癌症死亡的第四大原因。高危型人乳头状瘤病毒(High-risk human papillomavirus,HR-HPV)的持续性感染与宫颈癌的发生密切相关,它可能导致宿主基因发生SNP变异、片段缺失或重复、原癌基因的激活和抑癌基因的失活等一系列生物学变化。目前,宫颈癌发生、发展和转移的分子机制尚不清楚。对与宫颈癌相关的基因及功能进行研究,有利于探索宫颈癌发生的具体分子机制,有助于开发生物标记物和协助开发宫颈癌诊断和治疗的新靶点。细胞质多聚腺苷酸结合蛋白1(poly(A)binding protein cytoplasmic1,PABPC1)是RNA结合蛋白中PABP家族的一员,能调控RNA稳定相关蛋白复合体,与mRNA代谢、细胞生长发育和肿瘤的发生发展等诸多重要的生命活动有关。PABPC1在多种肿瘤组织中表达,与肿瘤的生长、转移等关系密切,然而其作用的分子机制尚不清楚。本课题通过转录组研究发现PABPC1在宫颈鳞癌组织中上调表达,推测该因子可能参与鳞癌发生发展的调控。因此本研究拟进行探讨PABPC1在宫颈鳞癌组织中的表达情况,分析其表达与相关临床病理参数的相互关系,并通过SiRNA干扰技术沉默PABPC1基因的表达,观察其低表达后宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞的增殖、迁移等生物学行为的改变,探讨PABPC1表达改变影响mTOR和AKT/MAPK信号通路调控肿瘤细胞的分子机制,进而为阐明宫颈癌的发生提供新的理论依据。
方法:1、探讨PABPC1在宫颈鳞癌组织中的表达情况及临床意义:采用免疫组织化学技术检测42例宫颈鳞癌组织以及癌旁组织中PABPC1蛋白的分布和表达情况,并分析PABPC1在癌组织中的表达与各临床病理特征的相关性。2、探究沉默PABPC1基因对宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞的体外生物学行为影响:(1)利用SiRNA干扰技术转染SiHa细胞,运用Real-Time PCR(RT-PCR)和Western Blot实验检测PABPC1mRNA及蛋白的表达变化,验证转染效率。(2)采用CCK8、平板克隆形成实验比较PABPC1基因沉默前后对SiHa细胞体外增殖和克隆形成能力的变化。(3)采用划痕实验和Transwell实验检测沉默PABPC1基因对SiHa细胞体外迁移和侵袭能力的影响。3、探讨沉默PABPC1在宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞中影响mTOR和AKT/MAPK信号通路的分子机制:Western Blot实验检测沉默PABPC1基因对SiHa细胞的mTOR和AKT/MAPK信号通路中AKT1、RPS6、ERK1/2、RKS1p90和Rab11等关键蛋白表达的影响。Real-Time PCR(RT-PCR)实验检测mTOR和ERK的RNA表达变化。
结果:1、PABPC1在宫颈鳞癌组织中的表达及临床意义:42例宫颈鳞癌样本免疫组织化学结果显示,PABPC1在宫颈鳞癌组织中的表达显著高于癌旁组织(P<0.01);PABPC1阳性表达与宫颈鳞癌的FIGO分期具有统计学相关性(P<0.05),而与年龄、肿瘤大小、组织分化程度、淋巴结转移等无显著相关性(P>0.05)。2、沉默PABPC1基因对宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞体外增殖能力、克隆形成能力、迁移能力和侵袭能力的影响:(1)建立瞬时沉默PABPC1的SiHa细胞细胞株体系,验证结果显示沉默PABPC1的SiRNA-1和SiRNA-2两个片段对SiHa细胞的沉默效率均符合实验要求。(2)CCK8和平板克隆形成实验结果显示:与对照组相比,沉默PABPC1基因后,SiHa细胞的体外增殖能力受到显著抑制,体外克隆形成能力也明显下降。(3)细胞划痕和Transwell实验结果显示:与对照组相比,沉默PABPC1基因后,SiHa细胞的体外迁移和侵袭能力均明显降低。3、在宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞中沉默PABPC1后,调控mTOR和AKT/MAPK信号通路的分子机制:Real-Time PCR(RT-PCR)和Western Blot检测结果显示,沉默PABPC1后,mTOR的mRNA及其磷酸化蛋白表达均明显下降;AKT/MAPK信号通路中的ERK mRNA水平和ERK1/2磷酸化Y204/187蛋白均表达下调。
结论:1、PABPC1在宫颈鳞癌组织中表达上调,其高表达与宫颈癌的FIGO分期相关。2、沉默PABPC1基因可以抑制宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞株体外增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力,因此PABPC1基因可能是癌驱动基因。3、PABPC1功能蛋白可能通过激活MAPK信号通路中ERK调节mTOR表达,进而促进宫颈鳞癌的发生。
方法:1、探讨PABPC1在宫颈鳞癌组织中的表达情况及临床意义:采用免疫组织化学技术检测42例宫颈鳞癌组织以及癌旁组织中PABPC1蛋白的分布和表达情况,并分析PABPC1在癌组织中的表达与各临床病理特征的相关性。2、探究沉默PABPC1基因对宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞的体外生物学行为影响:(1)利用SiRNA干扰技术转染SiHa细胞,运用Real-Time PCR(RT-PCR)和Western Blot实验检测PABPC1mRNA及蛋白的表达变化,验证转染效率。(2)采用CCK8、平板克隆形成实验比较PABPC1基因沉默前后对SiHa细胞体外增殖和克隆形成能力的变化。(3)采用划痕实验和Transwell实验检测沉默PABPC1基因对SiHa细胞体外迁移和侵袭能力的影响。3、探讨沉默PABPC1在宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞中影响mTOR和AKT/MAPK信号通路的分子机制:Western Blot实验检测沉默PABPC1基因对SiHa细胞的mTOR和AKT/MAPK信号通路中AKT1、RPS6、ERK1/2、RKS1p90和Rab11等关键蛋白表达的影响。Real-Time PCR(RT-PCR)实验检测mTOR和ERK的RNA表达变化。
结果:1、PABPC1在宫颈鳞癌组织中的表达及临床意义:42例宫颈鳞癌样本免疫组织化学结果显示,PABPC1在宫颈鳞癌组织中的表达显著高于癌旁组织(P<0.01);PABPC1阳性表达与宫颈鳞癌的FIGO分期具有统计学相关性(P<0.05),而与年龄、肿瘤大小、组织分化程度、淋巴结转移等无显著相关性(P>0.05)。2、沉默PABPC1基因对宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞体外增殖能力、克隆形成能力、迁移能力和侵袭能力的影响:(1)建立瞬时沉默PABPC1的SiHa细胞细胞株体系,验证结果显示沉默PABPC1的SiRNA-1和SiRNA-2两个片段对SiHa细胞的沉默效率均符合实验要求。(2)CCK8和平板克隆形成实验结果显示:与对照组相比,沉默PABPC1基因后,SiHa细胞的体外增殖能力受到显著抑制,体外克隆形成能力也明显下降。(3)细胞划痕和Transwell实验结果显示:与对照组相比,沉默PABPC1基因后,SiHa细胞的体外迁移和侵袭能力均明显降低。3、在宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞中沉默PABPC1后,调控mTOR和AKT/MAPK信号通路的分子机制:Real-Time PCR(RT-PCR)和Western Blot检测结果显示,沉默PABPC1后,mTOR的mRNA及其磷酸化蛋白表达均明显下降;AKT/MAPK信号通路中的ERK mRNA水平和ERK1/2磷酸化Y204/187蛋白均表达下调。
结论:1、PABPC1在宫颈鳞癌组织中表达上调,其高表达与宫颈癌的FIGO分期相关。2、沉默PABPC1基因可以抑制宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞株体外增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力,因此PABPC1基因可能是癌驱动基因。3、PABPC1功能蛋白可能通过激活MAPK信号通路中ERK调节mTOR表达,进而促进宫颈鳞癌的发生。