背景Twistl和Twist2都是碱性螺旋-环-螺旋结构蛋白家族(bHLH)中的Twist亚家族的成员。碱性螺旋-环-螺旋结构蛋白家族(bHLH)由一系列的转录因子组成,在不同组织中起着重要的调控作用。这一家族的蛋白可以分为三大类：第一类为广泛表达的A类碱性螺旋-环-螺旋结构因子,包括E2-2、HEB及E2A基因的两种同工型E12/E47(也命名为E蛋白)；第二类为组织特异性的B类碱性螺旋-环-螺旋结构因子：第三类为抑制性碱性螺旋-环-螺旋结构因子,由Id蛋白组成,这-类蛋白缺乏结合DNA的碱性区域。Twist首先在果蝇中被发现,属于B类bHLH因子[1]。在脊椎动物中,发现两个与果蝇Twist高度同源的蛋白,Twist1和Twist2(起初名为Dermol)[2,3]。Twist1和Twist2氨基酸序列上存在高达98%的相似性,并且在鼠胚胎发育过程中,两个基因呈现广泛的重叠表达模式[3,4]。Twist蛋白通过形成同源二聚体或者与其他蛋白形成异源二聚体在胚胎发育过程中起重要作用。Twist能与广泛表达的同属碱性螺旋-环-螺旋结构家族的E蛋白(E12/E47)形成异源二聚体,通过其结构中的碱性螺旋-环-螺旋与目标基因的E-box(序列为CANNTG)结合,从而调控目的基因的表达[5]。人类TWIST1基因定位于7p21.2处,含有2个外显子和1个内含子,第1个外显子长772bp,包含整个编码区域,内含子长为538bp, mRNA全长669bp。人类TWIST(?)基因的突变与Seathre-Chotzen (SCS; OMIM101400)综合征有关,这一综合征为常染色体显性遗传,以颅缝早闭及一些肢体及颅面异常为特征[6]。颅缝早闭(craniosynostosis)是一个相当常见的颅缝发育紊乱,出生发病率为1：2500[7],患者因颅缝的过早闭合可以出现尖头畸形。以颅缝早闭为特征的SCS综合征的病人中,80%存在TWIST(?)基因突变。Twist1单倍体缺失(Twist1-null heterozygous)的小鼠模型具有与人类SCS综合征类似的表型。随着小鼠胚胎发育的进展,Twist1的表达水平逐渐下降[8]。另外,体内及体外的有关实验表明,Twist1过表达将抑制成骨细胞分化[5,9,10]。因此,这些现象提示Twist1在成骨细胞分化及骨形成中起负性调节作用。Twist1负性调节成骨细胞分化的分子学机制可能有以下几种：1)Twist1可能调控FGF信号通路,尤其是在颅缝发育过程中调控Fgfr2的表达[7,11,12]。另外,遗传研究发现,FGFR2和FGFR.基因突变的病人中也存在颅缝早闭等一些类似SCS综合征的表型。这预示着TWIST1基因与FGF受体基因之间存在某种关联。人类分子遗传学研究认为颅缝早闭是由于FGF受体基因的激活性突变或是TWIST1基因突变引起的TWIST1单倍体不足导致[13-15]。2) Twist1可能直接调控并且抑制Runx2的转录激活功能[8,16]。3)在对从SCS病人的头盖骨分离的成骨细胞的研究显示,Twist1可能通过调节FGFR2的表达间接调控RUNX2的表达[17]。4)Twist1通过抑制FNF-α的表达抑制成骨细胞凋亡[18]。Twist2被认为在骨形成中和Twist1同样起负性调控的功能。而Twist2-KO的小鼠则表现为相对正常的胚胎发育,但大多于出生2-3天后死于恶病质[19]。但是同样的Twist2-KO小鼠在129/C57混合基因背景下却能够存活,仅仅存在一些轻微的异常表型[19]。最近的遗传研究发现,TWIST2基因同源性的无义突变导致Setleis综合征(MIM227260)[20]。Setleis综合征属于局灶性面部皮肤发育不良Ⅲ型(Focal Facial Dermal Dysplasia, FFDD),以两颞颥骨瘢样印记、上眼睫毛缺失等面部异常表现为特征。这一发现认为,即使TWIST1和TWIST2在序列上高度相同,但是两个基因在皮肤和骨发育中可能有各自独立的功能。然而,二者在骨和牙发育中的协同功能及其机制却并不清楚。为了研究Twist1与Twist2如何共同调控骨和牙发育及进一步探索它们在骨和牙齿发育中的作用及其机制,我们通过用Cre取代Twist2其中一个等位基因外显子区的小鼠(Twist2Cre Knock-in,基因型为Twist1+/-, Twist2Cre/+)与基因型为Twist1flox/flox, Twist2+/-小鼠交配获得Twistl和Twist2复合单倍体缺失(Twist1flox/+, Twist2cre/+)的小鼠(Twist1/2double heterozygote,下文中也简称为Twist1/2dHET),研究其骨及牙齿表型。并且通过Twistlflox/flox, Twist2+/-小鼠与Twist1/2dHET小鼠交配获得Twist2Cre Knock-in、Twistl条件性敲除(基因型为Twist1flox/flox, Twistcre/+,下文中也简称为Twist三个等位基因缺失)小鼠模型,以进一步研究在Twist1基因条件性敲除且Twist2单倍体缺失情况下骨和牙齿的表型。实验目的1.研究Twist1与Twist2如何协同调控骨发育。2.研究Twist是否抑制成骨3.探究Twist影响骨发育的可能机制4.研究Twist在牙齿发育的作用及其影响牙发育的可能机制材料和方法1.动物模型的构建Twist1floxed的小鼠(Twist1flox/flox)由Dr. Richard R. Behringer构建；Twist2Cre Knock-in的小鼠(Twist2Cre/+)由Dr. David M. Ornitz构建。通过基因型为Twistlflox/flox, Twist2+/+小鼠与基因型为Twist1+/-, Twist2Cre/+小鼠的交配得到基因型为Twist1flox/+, Twist2cre/+的小鼠。再通过用此基因型的小鼠与Twist1flox/flox, Twist2+/-小鼠交配获得Twist1flox/flox, Twisfre/+基因型的小鼠模型。2.标本制备年龄为一周的Twistl/2dHET小鼠及其同窝对照鼠用二氧化碳处死后,剥去皮肤及内脏,4%PFA固定后进行Alizarin Red/Alcian Blue染色及进行X一光及micro-CT分析。其中长骨(股骨和胫骨)经4%PFA固定24小时后换成10%EDTA,0.5%PFA脱钙一周,行梯度酒精脱水、石蜡包埋。Twist1flox/flox, Twist2+/-雌鼠与Twist1/2dHET雄鼠交配后,取第14.5、16.5、18.5天的胚胎,取下头部,4%PFA固定过夜,行梯度酒精脱水、石蜡包埋。3.组织学分析石蜡标本切片后进行H&E染色、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色。通过免疫组化染色及原位杂交技术检测成骨细胞及骨细胞的标志性蛋白(Alp、Ocn、Dmp1、Osterix, Biglycan)。通过Fgfr2及磷酸化的Erkl/2特异性抗体检测相应蛋白在骨组织中的表达。4.细胞增殖分析小鼠出生后第六天按10mg/100g体重注射溴脱氧尿苷(BrdU),次日处死小鼠前2小时行第二次BrdU注射。通过BrdU染色试剂盒检测骨组织中的细胞增殖情况,并进行计数统计分析。5.细胞凋亡分析通过荧光标记原位细胞凋亡检测试剂盒检测骨组织中细胞凋亡的情况。用DAPI进行细胞核衬染,统计分析干骨后端松质骨中细胞凋亡数目。6.实时荧光定量PCR取一周大的小鼠的股骨及胫骨,剥离皮肤及肌肉,用Trizol提取骨的总蛋白。应用逆转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA。通过实时荧光定量PCR检测Runx2、Osterix、 Ocn、Alp、Bsp、Dmp1等成骨细胞及骨细胞标记性基因的mRNA水平。另外,我们也同时检测了Fgf2及FGF受体基因及相应的效应因子基因Erm和Pea3表达情况。为了分析Twist基因对牙发育的影响,Twistlflox/flox, Twist2+/-雌鼠与Twist1/2dHET雄鼠交配后,取其怀孕14.5天的胚胎,并在体式显微镜下分离牙胚,提取RNA。通过实时荧光定量PCR检测(?)Fgf3、Fgf10及FGF有关受体基因的表达情况。7.双荧光素酶报告实验为了进一步确定Twist基因与Fgfr2的作用关系,我们分别构建了Twist1、Twist2及另一个广泛表达的dHLH家族成员E12的真核表达载体。同时构建含有4.9kb Fgfr2启动子区的荧光素酶报告基因载体。通过将Twist1、Twist2分别或它们与E12一起和4.9kb Fgfr2启动子荧光素酶报告基因载体、海肾荧光素酶载体共同转染于三种不同的细胞系：小鼠间充质干细胞C3H10T1/2、小鼠成骨细胞前体细胞MC3T3-E1、成牙本质样细胞MDPC-23。48小时后,收集细胞裂解液,进行双荧光素酶报告基因分析。三个不同细胞系中分别重复三次,每次每组三个副孔。结果1. Twist基因缺陷小鼠的骨骼和牙齿发育异常全部’Twist1和Twist2复合单倍体不足的小鼠比同窝对照鼠个头小且生长较慢,大部分在出生后两周内死去,只有极少数能活到成年。Alizarin Red/Alcian Blue染色显示Twist1/2dHET小鼠轴向骨的变短、额间骨缝迟闭、枕囟开放。X线及micro-CT显示Twistl/2dHET小鼠骨形成减少。通过定量分析股骨和胫骨,Twistl/2dHET小鼠的骨体积及密度都较对照鼠明显降低。H&E染色显示Twistl/2dHET小鼠股骨及胫骨中松质骨长度及皮质骨厚度、骨膜厚度均减少。Twistl/2dHET小鼠的第一、第二磨牙发育正常,是第三磨牙在其出生后一周时发育滞后,但在出生后四周可见萌出正常的第三磨牙。Twist1、Twist2三个等位基因缺失的小鼠存在严重的颅骨、上下颌骨发育不良,另外还存在大脑发育异常、脐疝、多趾等表型,无法活到出生后；其牙胚发育较对照组滞后且牙胚较小、牙尖形态发育异常。2. Twist影响成骨细胞分化免疫组化及原位杂交显示,Twistl/2dHET小鼠长骨组织中成骨细胞及骨细胞标志性蛋白(包括Alp、Ocn、Dmp1、Osterix, Biglycan)的表达均较对照组降低,说明‘Twist基因影响成骨细胞分化。而‘TRAP染色显示Twistl/2dHET小鼠的破骨细胞大小、分布和数目与对照组相比并没有明显异常。3. Twist影响成骨细胞及其前体细胞增殖BrdU染色及统计分析显示Twistl/2dHET小鼠在干骨后端松质骨及骨干中段皮质骨中增殖细胞较对照鼠明显减少。然而,原位细胞凋亡实验检测Twistl/2dHET小鼠同一区域的细胞凋亡数目相比对照组并无明显增加。4. Twist在骨和牙组织中影响FGF信号通路的表达实时荧光定量PCR显示在Twistl/2dHET骨组织中,Fgf2及FGF受体基因的表达较对照明显下降。免疫组化进一步证实Twistl/2dHET骨组织中Fgfr2表达较对照标本明显减弱。同时,FGF信号通路激活的MAP激酶通路中的磷酸化Erkl/2及其下游效应基因Erm和Pea3的表达均相应降低。说明在Twit1、Twist2复合单倍体缺失的骨组织中FGF信号通路受到抑制。另外,通过体外分离牙胚组织提取的RNA进行实时荧光定量PCR检测,在Twist三个等位基因缺失的E14.5天的牙胚组织中,Fgf3、Fgfl0及Fgfr1、Fgfr2的表达相较对照组明显降低。5. Twist与E12协同激活Fgfr24.9kb启动子活性双荧光素酶报告基因实验显示,在成牙本质样细胞MDPC-23中,单独Twist1或Twist2能够刺激Fgfr24.9kb启动子的活性,而在小鼠间充质于细胞C3H10T1/2及小鼠成骨细胞前体细胞MC3T3-E1中却不能。而当Twist1或Twist2与E12共同转染时,它们形成的异源二聚体能够明显增强Fgfr24.9kb启动子的活性,这一结果在三种测试的细胞系中都一致。结论1. Twist1和Twist2在骨发育过程中起协同调节作用2. Twist1和Twist2通过影响成骨细胞增殖和分化调节骨的形成和发育3. Twist1和Twist2复合单倍体不足时Fgf2和FGF受体基因的表达受抑制、FGF信号通路降低4. Twist1和Twist2能够与E12协同促进Fgfr2启动子活性5. Twist1和Twist2通过Fgf信号通路影响牙尖形态发育背景：颅骨锁骨发育不良综合征(CCD)是由RUNX2基因单倍体不足引起的常染色体显性遗传综合征。这一综合症的主要特征是牙发育异常、颅缝闭合不全或闭合延迟、锁骨缺失或发育不良及其他骨骼异常。目的：研究来自3个不同家族的7个CCD患者的表型及分析RUNX2基因的突变,并且对突变RUNX2基因亚细胞定位的分析。方法：对临床收集的7个来自3个不同家族的CCD患者及其家族中的健康成员,从外周血提取基因组DNA,利用针对RUNX2基因的特异性引物进行PCR及测序。通过比对测序结果与NCBI中的RUNX2基因序列,检测RUNX2的突变情况。通过体外构建含RUNX2cDNA的质粒,并对通过定点突变技术研究RUNX2基因突变对其亚细胞定位的影响。结果：来自3个不同家族的CCD患者中发现了3种RUNX2基因的框移突变。其中有2个为新突变,另一突变曾经有过报道。发现的新突变中,其中一个是在cDNA第887个碱基有一个C碱基的插入突变(c.887insC),导致密码子框移,终止密码提前出现；另一个是在cDNA第592个碱基中缺失一个A碱基(c.592delA),同样也是导致密码子框移、终止密码提前出现。第三个突变为cDNA第90个碱基中插入C碱基(c.90insC)。通过亚细胞定位分析发现,c.592delA和c.90insC突变导致RUNX2亚细胞定位发生了改变。结论：我们的研究进一步支持RUNX2的单倍体不足导致CCD这一观点。然而,临床表型的严重程度与RUNX2基因的突变受损程度并不存在关联性。另外,RUNX2经典核定位信号区的缺失并不导致RUNX2的核定位功能的完全丧失,这也为RUNX2可能存在第二个核定位信号的观点提供支持。